临床检验免疫主管 (9)

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临床医学检验主管技师考试辅导《临床免疫学和免疫检验》第九章酶免疫技术

第一节酶免疫技术的特点酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。

它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，此结合物既保留了抗体或抗原的免疫学活性，同时又保留了酶对底物的催化活性。

在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位.定性或定量的测定分析。

它通过利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高了抗原抗体反应的敏感性。

它具有检测灵敏度高.特异性强.准确性好.酶标记试剂能够较长时间保持稳定.操作简便.对环境没有污染等优点，而且容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。

一.酶和酶作用底物

（一）酶的要求

1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。

2.易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。

3.作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。

4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行.敏感和重复性好。

5.酶.辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制.保存，酶及其底物应价廉易得。

（二）常用的酶

1.辣根过氧化物酶（HRP）

2.碱性磷酸酶（AP）

3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）

（三）常用的底物

1.辣根过氧化物酶的底物（1）邻苯二胺（OPD） 0PD均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液中。

（2）四甲基联苯胺（TMB） ELISA中应用最广泛的底物。

（3）其他：5-氨基水杨酸（5-ASA）和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）也是HRP常用的底物。

2.碱性磷酸酶（AP）的底物

3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）常用对-硝基苯磷酸脂（p-NPP），p-NPP经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

常用4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生

成高强度荧光物4-甲基伞形酮（4-MU），其敏度性较HRP高30～50倍，但测量时需用荧光计。

二.酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原是指通过化学反应

或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物，也称酶标志物或

酶结合物。

（一）酶标记抗体或抗原的制备用于制备酶标志物的抗原要求纯度高，抗原性完整（半抗原应先与大分子载体蛋白交联）。

抗体则不仅需要特异性好.效价高.亲和力强以及比活性较

高，而且还需要能批量生产和易予分离纯化。

目前常根据具体方法要求选用单克隆抗体.多克隆抗体经纯化的Ig组分.Ig的Fab 和F（ab’）2片段等。

1.戊二醛交联法

2.改良过碘酸钠法目前用于HRP标记抗体或抗原的最常用方法

（二）酶标志物的纯化标记完成后应除去反应液中的游离酶.游离抗体或抗原。

常用的纯化方法有葡聚糖凝胶C-200／G-150过柱层析纯化和50%饱和硫酸铵沉淀提纯。

（三）酶标志物的鉴定质量鉴定包括酶活性和抗体（抗原）的免疫活性鉴定。

常用免疫电泳或双向扩散法，出现沉淀线表示酶标志物中的抗体（抗原）具有免疫活性。

沉淀线经生理盐水反复漂洗后，滴加酶的底物溶液，若在沉淀线上能显色，则表示酶标志物中的酶活性仍保留。

三.固相载体

（一）固相载体的要求结合抗体或抗原的容量大；可将抗体或抗原牢固地固定在其表面，经长期保存和多次洗涤也不易脱落；不影响所固定的抗体或抗原的免疫反应性，而且为使反应充分进行，最好其活性基团朝向反应溶液，固相方法简便易行，快速经济。

（二）固相载体的种类和选择

1.塑料制品

2.微粒

3.膜载体

（三）包被与封闭

1.包被将抗原或抗体结合在固相载体上的过程称为包被。

2.封闭需用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清再包被一次，消除非特异性显色，此过程称为封闭。

第二节酶免疫技术的分类酶免疫技术按实际应用目的可分为两大类：酶免疫测定（EIA）：液体标本中抗原或抗体的定性和定量。

酶免疫组织化学技术：组织切片或其他标本中抗原的定位。

根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标志物分离，EIA一般可分为均相和异相两种类型。E IA反应原理简示如下（标记抗体过量）： AgAbE+Ab—E Ag为待检测抗原，AgAb-E为被结合酶标抗体，Ab-E先游离酶标抗体。异相EIA为抗原抗体反应后；需先将AgAb-E与Ab-E分离，然后再测定AgAb-E或AbE催化底物显色的活性，最后推算样品中Ag的含量。E IA可分为液相EIA和固相EIA：前者反应原理同放射免疫分析，试剂抗原（抗体）和待测抗体（抗原）均为液体，免疫反应在液体中进行，最后需用分离剂将游离与结合标志物分离后测定。

固相EIA则是先需制备一种固相的试剂抗原（抗体），再与样品待测抗体（抗原）以及酶标抗原（抗体）反应，经洗涤去除未结合的游离标志物后，即可对结合于固相载体的抗原抗体复合物进行测定。E IA均相法反应原理如下：均相法则是利用Ab-E 结合Ag形成AgAb-E复合物后，标记酶（E）的活性会发生改变，可以在不将AgAb-E与Ab-E分离的情况下，通过直接测定系统中总的标记酶活性改变，即可确定AgAb-E的形成量，并进而推算出样品中待检Ag的浓度。

均相酶免疫测定：均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定。

均相法的优点是适合于自动化测定。

最早取得临床实际应用的均相酶免疫试验是酶放大免疫测定技术（EMIT）。