分子诊断策略与常用技术

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正常人
+
突变携带着 患者
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镰状红细胞贫血患者基因组的ASO探针杂交
Normal βΑGene Probe——与正常 Probe βΑ杂交稳定 Mutation βS Gene Probe——与异常
βS杂交 稳定
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PCR/单链构象多态性分析（SSCP）
➢ 原理
将经扩增的DNA片段变性形成单链，由于序列不同，单 链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率 不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。
➢ 优点
• 检测基因变异，具有操作简便、快速特点，不需特殊设 备，适用于大样本筛选。 • 己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变， 基因的多态性分析等。
DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类：
1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记； 2）重复序列多态性（VNTR）：如STR其重复次数在人群中存在 变异，形成多态即 VNTR ，为第二代多态性标记； 3）单碱基多态性（SNP）：发生在基因组中的单个核苷酸的替 代，为第三代多态性标记。
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等位基因特异寡核苷酸探针（ASO）
引物1 5’
点突变（C to T）
探针1 3’
G
3’
引物2 5’
探针2 3’
5’
A
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限制性片段长度多态性分析（RFLP） ➢ 原理
指DNA序列上发生一个变异后获得或丢失了一 限制性识别位点，使DNA限制性片段长度发生 变化，在人群中形成两种或两种以上的限制性 类型 利用特定限制性识别位点进行基因分析
一、分子诊断的概念和特点
特点
特异性强
分子诊断的前提
灵敏度高
早期诊断性 已明确疾病表型与基因型的关系
适应性强
检测致病基因突变；分析与疾病连锁的遗传标志；建立 多基因疾病表型克隆；定量分析致病基因的表达水平
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二、分子诊断策略
直接诊断——直接检测致病基因的突变
基因突变类型—缺失、点突变、重复、插入等
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RLFP分析法
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RFLP分析
➢ 优点 • 分辩率高，无需标记,重复性好，简便快速直观 • 主要用于核酸变异分析比较, 微生物的分群分型， 癌基因分析，遗传病的诊断等。 ➢ 局限
只能应用突变引起限制性酶切位点改变筛选，检测 效率低。
镰状红细胞贫血患者基因组的ASO探针杂交 斑点杂交结果： βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS
正常探针 异常探针
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Leber 病患者 PCR/SSCP分析
﹣
+
正常人
纯合突变 杂合突变
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镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)
GAG → GTG ↓
谷Aa→缬Aa 5´
3´
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×
正常基因
5´
3´
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突变基因
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镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
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﹣
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一、分子诊断的概念和特点
概念：
利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法， 通过检测基因结构或其表达水平是否正常，从而对人 体健康状态和疾病作出诊断的方法。
传统的诊断：表现型→基因型 基 因 诊 断：基因型→表现型
（ 逆向诊断）
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间接诊断——应用DNA多态性为遗传标记进行连锁分析，
确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而间接地作出 诊断
DNA多态——RFLP、VNTR、SNP
3
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二、分子诊断策略
DNA多态（DNA Polymorphism）
群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种 或两种以上的形式，对基因功能没有影响，称DNA多态。
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三、分子诊断常用技术
核酸分子杂交技术 等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific
oligonucleotide, ASO) DNA限制性长度多态性(restriction
fragment length polymorphism, RLFP)分析 PCR-SSCP DNA测序 DNA芯片技术
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（ PCR-SSCP）示意图
Leabharlann Baidu
DNA测序
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DNA自动测序结果举例 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
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DNA芯片技术
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四、分子诊断的应用及举例
遗传疾病 肿瘤 感染性疾病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定