几丁质酶的活性测定(精)

几丁质酶活性的测定
⑴几丁质酶
几丁质是绝大多数真菌细胞壁的主要成份，而在植物中却不存在。

但高等植物普遍存在着几丁质酶，并可通过几丁质酶催化几丁质的水解，使植物具有抵御真菌侵染的能力（Shibuya and Minami, 2001）。

在正常情况下，高等植物的几丁质酶表达水平很低，而当植物体遭受到病原真菌、细菌和病毒侵染，机械创伤或乙烯处理时，其表达活性显著增强。

特别是在β-1,3-葡聚糖酶的协同作用下，可明显抑制真菌的生长（Sela-Buurlage et al., 1993）。

几丁质酶是植物体中与防御有关的一种次生水解酶，是植物广谱防御机制的一个成分（V an Loon and Van Strien, 1999），它能催化真菌细胞壁的重要成分——几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物的抗真菌能力。

而植物体中尚未发现几丁质酶作用的底物，所以，几丁质酶在植物体中诱导与积累，对于增强植物的抗病能力有重要作用。

几丁质酶主要水解几丁质多聚体β-1,4键，产生N-乙酰葡聚糖胺寡聚体，水解可以是外切作用也可以是内切作用。

⑵试剂的配制
①胶状几丁质的制备
称取粉末状几丁质（甲壳素，sigma）5.0 g，缓慢加入200 mL （≤4℃）预冷的浓HCl中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，待几丁质粉末均匀分散后，在水浴中轻度搅拌并缓慢加热至37 ℃混合物的粘度迅速增加，几分钟后粘度开始下降，混合物逐渐变得清亮。

当几丁质基本上溶解完毕时，用玻璃棉过滤，将滤液倒入2000 mL预冷（≤4℃）的蒸馏水中，搅拌，几分钟后几丁质沉淀，溶液变得混浊，30分钟后停止搅拌，将悬液置于冰箱(≤4℃)沉淀过夜。

倒掉上清，剩余部分用双层中性滤纸抽滤，沉淀用蒸馏水洗涤数次，待pH达到5以上时，加数滴1 N NaOH使溶液呈中性。

将上述中性沉淀物加到200 mL的蒸馏水中，剧烈搅拌重新悬浮，即为胶体几丁质溶液。

取该溶液5 mL, 105℃烘箱干燥至衡重，测定溶液几丁质的含量（胶体几丁质溶液的几丁质含量为: mg/mL），并将胶体几丁质溶液浓度稀释为1%。

②1%对二甲氨基苯甲醛（1% DMAB）
称取1 g对二甲氨基苯甲醛，加入少量冰醋酸溶解，再加1.25 mL浓HCl，最终用冰醋酸定容至100 mL.（溶液呈黄色）
③饱和硼砂
称取5.0 g四硼酸钠（Na2B4O7·10H2O），溶于100 mL热水中，冷却后备用。

⑶几丁质酶活性的测定
①几丁质酶的提取
称取0.1g水稻叶片，液氮研磨成粉末，加2 mL醋酸提取液（0.05 mol/L，pH5.0），转移入2 mL 离心管，4℃下12000 r/min离心15 min，上清液转移到新的1.5 mL离心管中，4℃冰箱中保存备用。

②外切几丁质酶活性测定
1.2 mL反应混合液中含0.4 mL粗酶提取液、0.4 mL醋酸缓冲液（0.05 mol/L，pH5.0）和0.4 mL 胶体几丁质溶液（1%）。

37 ℃水浴反应2 h后，4000 r/min离心10min，终止反应。

参考Reissig等(1955)的方法测定上清液中的N-乙酰葡萄糖胺量。

方法是取0.4 mL上清液，加0.2 mL饱和硼砂溶液（上清液即刻变黄色），沸水浴7 min，冷却后再加2 mL冰醋酸和1 mL 1%对二甲氨基苯甲醛（DMAB）溶液，37 ℃水浴保温15min后（溶液呈红色），585nm处测定溶液吸光值。

③内切几丁质酶活性测定
取0.4 mL上述上清液，加40 μL 1%蜗牛酶溶液，继续在37 ℃反应30 min，用上述Reissig等(1955)的方法测定产生的N-乙酰葡萄糖胺量，即得总几丁质酶活性。

总几丁质酶活性减去外切几丁质酶活性，即为内切几丁质酶活性。

一个酶活性单位(U)定义为每克鲜植物组织每小时分解胶体几丁质产生1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量。

④N-乙酰葡萄糖胺标准曲线的制备
参考文献：
肖拴锁, 王钧. 水稻中超氧诱导与稻瘟菌抗性及苯丙氨酸解氨酶、几丁酶、β-1,3-葡聚糖酶活性诱导的关系. 中国水稻科学, 1997 (02): 93-102.
Reissig JL, Strominger JL, Leloir LF. A modified colorimetric method for the estimation of N-acetylamino sugars. Journal of Biological Chemistry, 1955, 217: 959-966.
Sela-Buurlage MB, Ponstein AS, Bres-Vloemans SA, Melchers LS, van den Elzen PJM, Cornelissen BJC.
Only specific tobacco (Nicotiana tabacum) chitinases and β-1,3-glucanases exhibit antifungal activity.
Plant Physiology, 1993, 101(3): 857-863.
Shibuya N, Minami E. Oligosaccharide signalling for defence responses in plant. Physiological and Molecular plant pathology, 2001, l59: 223-233.
Van Loon LC, Van Strien EA. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1999, 55(2): 85-97.。