几丁质酶的活性测定(精)
产几丁质酶芽孢杆菌的筛选鉴定和酶活力测定_顾真荣
上海农业学报2001,17(3):92～96 Acta Agriculturae Shanghai 文章编号:1000-3924(2001)03-92-05产几丁质酶芽孢杆菌的筛选鉴定和酶活力测定顾真荣 马承铸(上海市农业科学院植物保护研究所,上海201106)韩长安(上海市农业技术推广服务中心,上海201103) 摘 要 从103份采自中国各地的土样中分离得到了312株芽孢杆菌,用平板透圈法筛选到3株产几丁质酶菌株G 1、G 2和G3。
经鉴定,G1为短芽孢杆菌(Bacillus brevis );G2为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis );G3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )。
它们在几丁质平板上的透明圈直径以G1>G 3>G2为序,在以Schales '法测定壳聚糖酶活力时,其摇瓶发酵上清液的酶活力以G 3>G1>G2为序。
本文首次报道短芽孢杆菌产生几丁质酶和壳聚糖酶。
关键词 芽孢杆菌;几丁质酶;筛选;鉴定;测定中图分类号:Q 55;Q 939.124 文献标识码:A 几丁质又称甲壳素,是广泛分布于自然界的生物多聚物,每年都有上百亿吨的生物量产生,数量仅次于纤维素。
几丁质和几丁质酶的利用一直是生命科学中的重大课题,在环境保护、医学、化学和农业等方面具有重大的潜在应用价值[1,2]。
几丁质酶广泛存在于植物、动物和微生物中。
细菌的几丁质酶由于潜在的商业用途倍受人们关注,粘质沙雷氏菌(Serratia marc enscens )是人们长期来研究的热点[3]。
对环境和卫生方面安全的芽孢杆菌亦有较多的研究。
已报道能产几丁质酶的芽孢杆菌有环状芽孢杆菌(B .circulans )[4,5]、蜡状芽孢杆菌(B .cereus )[4]、地衣芽孢杆菌(B .licheniformis )[4]和枯草芽孢杆菌(B .subtilis )[4,6]。
黄粉虫几丁质酶的纯化及性质
（ 泉州师范学 院 化学与生命科学学院福建省分子生物与药物化学重点实验室 ， 福建 泉州 摘 ３２ ０） ６０ ０
要： 以黄粉虫为材料 ， 采用盐析 、 亲和柱层析、ｅｈｄｘＧ－ Ｏ Ｓｐ ａｅ ｌ 分子筛及 Ｄ －２离子交换柱层析等制得纯 Ｏ Ｅ５
１ ２ 方法 ．
１２ １ 胶体几丁质的制备 ．．
称取 ２ ｇ片状的几 丁质 ， 加入 ２ Ｌ８ 的浓磷酸溶解 ， Ｏｍ ５ 室温下放 置 ２ 后 ， ｄ 用蒸馏
水反复冲洗胶状几丁质至 ｐ ． Ｈ ５０以上 ， 再用蒸馏水调胶体几丁质至终浓度为 １ Ｌ． ７ ］ １２ ２ 再 生几丁质的制备 将 ２ 几丁质浸在 ２ ０ Ｎ Ｏ ．． ０ｇ ０ ４ ｍＬ ７ ａ Ｈ溶液 中，２ １ １℃下于烘箱保温 ２ ｎ 冲 ０ ｍｉ后 洗至中性 ，Ｏ℃烘干得脱乙酰几 丁质 ． ５ 采用 Ｍｏ ｎ 法 ， ｌ ｏ 称取脱 乙酰几丁质 １ ａ ０ ｇ于 １０ １ Ｏ 乙酸中溶解 ， ５ Ｌ １ ｎ 静
步 甲属， 是一种 大型 的仓 储 害虫． 其全 身是 宝 ， 不仅 是生理 学 、 遗传 学 的实 验 材料 ， 还是 营 养 丰富 的高蛋 白
资 源 ．
几丁质酶 （ Ｃ３２ １ １） Ｅ ．． ．４ 广泛存在于各种微生物 、 动物 和植物 中， 是一类能把几 丁质 降解成 乙酰氨基葡
萄糖或者寡聚 Ｎ 乙酰氨基葡萄糖 的水解酶 ， 自然界的碳循环 中具有重要 的作 用嘲． ＿ 在 此外 ， 几丁质酶与生物体 自溶 、 形态发生和营养代谢具有密切关 系． 在植物体 内， 几丁质酶具有 增强植物 防卫 能力 的功 能［ ． 昆虫体 ｝ 在 内， 几丁质酶与昆虫的周期性蜕皮具有相关性 ， 蜕皮前几丁质酶 的表达量增加以促进蜕皮 ， 而后酶的表达量减少 以抑制蜕 皮 ． 近年来 ， 国内外对微生物几丁质酶的研究较多， 对动物几丁质酶 的研究相对 比较薄弱． 目前 ， 国内外关于黄粉虫的生理特性 、 饲养方法有不少报道 ， 但与其生长密切相关的酶学研究却很少． 国内 外有关黄粉虫几丁质酶的分离纯 化及性质研究 还未 见报道． 本实验 以黄粉虫 为材料 ， 采用 盐析、 亲和柱层析 、 Ｓｐａ ｅ －０ 分子筛柱层析 、 Ｅ Ｅ５ 离子交换柱层析等方法纯化几 丁质酶制剂 ， ｅｈｄｘＧ １０ Ｄ Ａ －２ 并在此基础上 ， 进一步研究 酶催化胶体几丁质水解 的最适 ｐ 最适温度 、Ｈ稳定性 、 Ｈ、 ｐ 热稳 定性 、 氏常数 等酶学性质 ， 米 研究结果将为黄粉
产几丁质酶的筛选及活力测定
产几丁质酶的筛选及活力测定一、实验材料1.菌种：白僵菌，或其他菌种及土壤采样等(菌种接种于PDA斜面上，28℃，80％RH 培养14 d后分别置于4℃和20℃备用。
)2.试剂：DNS试剂:（称取3，5-二硝基水杨酸3．15 g，加水500 mL。
，搅拌5 s，水浴至45。
然后逐步加入100 mL 0．2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。
直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。
再逐步加入四水酒石酸钾钠91．0 g苯酚2．5 g和无水亚硫酸钠2．5 g。
继续45"C水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL。
用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7 d后可以使用。
) 几丁质酶基础培养基(g／L)：葡萄糖5．09，蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，FeS04·2H20 0．1 g，pH 7．0。
几丁质酶诱导培养基(g／L)：蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，ZnS04·7H202 0．01 g，胶体几丁质10 ml，pH 7．0。
（胶体几丁质固体培养基。
0.5 g K2HPO4，0.5 gKH2PO4，0.5 g MgSO4·H2O，0.1 g FeSO4·7H2O，0.1 gZnSO4·7H2O 500 ml 1%胶体几丁质，500 ml蒸馏水，15 g 琼脂，pH7.2，121℃灭菌15 min，冷却至50℃左右倒平板）马铃薯培养基(PDA)；去皮的马铃薯200 g切块，沸水煮30 min，纱布过滤，20 g蔗糖，209琼脂，加热至全部溶解，定容至1 L。
二、筛选1.初筛采用平板透明圈法。
用0．1 mL孢子悬液(1×107／mL)滴于几丁质平板的中央(每个样品重复3次)，28℃培养7d，其菌落周围有透明圈出现。
淡紫拟青霉MD1几丁质酶活性测定
育结束的标志[16]。
依据枯叶蛱蝶越冬期间体内RNA 和DNA 等主要化学物质的含量变化，初步认为其滞育发育阶段主要经历了滞育期、滞育完成期和无滞育发育期，没有滞育发育结束期和滞育发育后期或者有但很短。
在整个越冬滞育期间，RNA/DNA 比值变化与RNA 和水分变化不一致[14]，据此认为利用RNA/DNA 比值区分枯叶蛱蝶发育阶段具有一定局限性。
参考文献：[1]Danks H V ．Insect dormancy ：an ecological perspective[M]．Otttawa ：Biological Survey of Canada ，1987．[2]Tauber M J ，Tauber C A ．Seasonal adaptations of insects [M]．Landon ：Oxford University Press ，1986．[3]王满囷，李周直．昆虫滞育的研究进展[J]．南京林业大学学报（自然科学版），2004，28（1）：71-76．[4]Masaki S ．Summer diapause[M]．Ann Rev Entomol ，1980，25：1-25．[5]苏天运，苏天增．昆虫滞育化学机制研究概况（上）[J]．四川动物，1995，14（3）：113-116．[6]苏天运，苏天增．昆虫滞育化学机制研究概况（下）[J]．四川动物，1995，14（4）：166-169．[7]易传辉，陈晓鸣，史军义，等．蝴蝶滞育研究进展[J].浙江林学院学报，2007，24（4）：504-510．[8]易传辉，陈晓鸣，史军义，等．光周期和温度对枯叶蛱蝶幼虫生长发育的影响[J]．昆虫知识，2008，45（4）：597-599．[9]易传辉，陈晓鸣，史军义，等．光周期对枯叶蛱蝶幼虫生长发育的影响[J]．西北林学院学报，2008，23（5）：124-126．[10]周成理，史军义，易传辉，等．枯叶蛱蝶Kallima inachus 的生物学研究[J]．四川动物，2005，24（4）：445-450．[11]杨萍，漆波，邓合黎，等．枯叶蛱蝶的生物学特性及饲养[J]．西南农业大学学报（自然科学版），2005，27（1）：44-49．[12]周成理，史军义，陈晓鸣，等．枯叶蛱蝶规模化人工繁育研究[J]．北京林业大学学报，2006，28（5）：108-113．[13]张韵梅．棉铃虫蛹在滞育中脂肪、糖原等化学成分含量变化的研究[J]．山东农业大学学报，1994，25（2）：147-150．[14]易传辉．美凤蝶与柑橘凤蝶和枯叶蛱蝶的滞育生态学研究[D]．北京：中国林业科学研究院，2007：1-168．[15]蒋明星，张孝羲．南京地区棉铃虫越冬蛹滞育的解除与发育[J]．昆虫学报，1997，40（4）：366-373．[16]仵增祥，袁锋，李怡萍．麦红吸浆虫幼虫滞育状态及其核酸含量变化研究[J]．西北农林科技大学学报，2003，31（6）：49-53．淡紫拟青霉MD1几丁质酶活性测定卓侃1，李玉中1，2，廖金铃1（1.华南农业大学资源环境学院，广东广州510642；2.衡阳师范学院，湖南衡阳421008）摘要：应用胶体几丁质平板透明圈法和DNS 法测定了淡紫拟青霉MD1的几丁质酶活性，首次获得淡紫拟青霉在胶体几丁质平板上的透明圈，DNS 法测定MD1几丁质酶活性结果表明，粗酶液无论是否有几丁质诱导，MD1菌株的几丁质酶活力均在第7d 最高，而且几丁质诱导的粗酶液酶活明显比同期未经几丁质诱导的粗酶液酶活高。
中国鲎几丁质酶的酶学性质研究
中国鲎几丁质酶的酶学性质研究林建城;王丽英;林娟娟【摘要】以中国鲎为材料,自内脏中提取几丁质酶(EC3.2.1.14),研究其酶学性质.结果表明,中国鲎几丁质酶的最适pH为5.4,最适温度为55℃;酶在pH4.6～6.0区域较为稳定,在20～60℃内具有较好的热稳定性.以胶体几丁质为底物测得中国鲎几丁质酶的米氏常数为2.175 m g/m L,最大反应速度为1.456μmol/(mL·min).金属离子Li+、Na+、K+、Mg2+和Fe2+对几丁质酶活力无影响;Ca2+和Ba2+对酶有微弱的激活作用;Co2+、Cu2+和Fe3+在低浓度时对酶有激活作用,随浓度增大则表现为抑制作用;Ni2+、Mn2+、Al3+、Cd2+、Pb2+、Zn2+和Hg2+对酶均具有不同程度的抑制作用,以Hg2+的抑制作用最显著,10 mmol/L Hg2+会使几丁质酶失活83.0％.甲醇、乙醇、异丙醇和正丙醇对几丁质酶的抑制作用均呈浓度效应,甲醇对酶的抑制作用较强;丙酮对酶有激活作用,而二氧六环和二甲亚砜在低浓度下对酶有微弱的激活作用,随浓度升高则表现为抑制作用.说明中国鲎几丁质酶活力易受环境中酸碱度、金属离子和有机溶剂的调控.【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2019(038)005【总页数】8页(P702-709)【关键词】中国鲎;几丁质酶;酶学性质;金属离子;有机溶剂【作者】林建城;王丽英;林娟娟【作者单位】莆田学院环境与生物工程学院 ,福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室 ,福建莆田351100;莆田学院环境与生物工程学院 ,福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室 ,福建莆田351100;莆田学院环境与生物工程学院 ,福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室 ,福建莆田351100【正文语种】中文【中图分类】S917Broadway等[1]根据几丁质酶作用机理不同，认为其至少包含内切几丁质酶(EC3.2.1.14)、外切几丁质酶和具外切酶性质的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52，NAGase)等3种组分。
几丁质酶的活性测定
几丁质酶活性的测定⑴几丁质酶几丁质是绝大多数真菌细胞壁的主要成份，而在植物中却不存在。
但高等植物普遍存在着几丁质酶，并可通过几丁质酶催化几丁质的水解，使植物具有抵御真菌侵染的能力（Shibuya and Minami, 2001）。
在正常情况下，高等植物的几丁质酶表达水平很低，而当植物体遭受到病原真菌、细菌和病毒侵染，机械创伤或乙烯处理时，其表达活性显著增强。
特别是在β-1,3-葡聚糖酶的协同作用下，可明显抑制真菌的生长（Sela-Buurlage et al., 1993）。
几丁质酶是植物体中与防御有关的一种次生水解酶，是植物广谱防御机制的一个成分（V an Loon and Van Strien, 1999），它能催化真菌细胞壁的重要成分——几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物的抗真菌能力。
而植物体中尚未发现几丁质酶作用的底物，所以，几丁质酶在植物体中诱导与积累，对于增强植物的抗病能力有重要作用。
几丁质酶主要水解几丁质多聚体β-1,4键，产生N-乙酰葡聚糖胺寡聚体，水解可以是外切作用也可以是内切作用。
⑵试剂的配制①胶状几丁质的制备称取粉末状几丁质（甲壳素，sigma）5.0 g，缓慢加入200 mL （≤4℃）预冷的浓HCl中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，待几丁质粉末均匀分散后，在水浴中轻度搅拌并缓慢加热至37 ℃混合物的粘度迅速增加，几分钟后粘度开始下降，混合物逐渐变得清亮。
当几丁质基本上溶解完毕时，用玻璃棉过滤，将滤液倒入2000 mL预冷（≤4℃）的蒸馏水中，搅拌，几分钟后几丁质沉淀，溶液变得混浊，30分钟后停止搅拌，将悬液置于冰箱(≤4℃)沉淀过夜。
倒掉上清，剩余部分用双层中性滤纸抽滤，沉淀用蒸馏水洗涤数次，待pH达到5以上时，加数滴1 N NaOH使溶液呈中性。
将上述中性沉淀物加到200 mL的蒸馏水中，剧烈搅拌重新悬浮，即为胶体几丁质溶液。
取该溶液5 mL, 105℃烘箱干燥至衡重，测定溶液几丁质的含量（胶体几丁质溶液的几丁质含量为: mg/mL），并将胶体几丁质溶液浓度稀释为1%。
一种简便易行的几丁质酶纯化法
一种简便易行的几丁质酶纯化法张新军;岳海梅;张伏军;范丽卿【摘要】传统的纯化微生物产几丁质酶的方法步骤繁琐、不易控制、得率较低。
经过实验探索得出一种较简单、快速、并可批量处理的几丁质酶纯化法。
将含有几丁质酶的发酵上清液与胶体几丁质混合后离心，几丁质酶随胶体几丁质沉降而与其他成分分离，用蒸馏水洗涤沉淀，再用蒸馏水重悬，放入30℃恒温箱温育72h，胶体几丁质被完全水解，从而得到纯几丁质酶。
此纯化方法条件温和，可保证纯化后的酶保持其生物活性。
SDS—PAGE检测及比色法对其纯度检测表明几丁质酶纯化回收率达到88．53％。
%Traditional purification of chitinase from the fermentation supernatant had some weaknesses such as complicated steps, difficult in controlling and low recovery ratio. Then we took experimental exploration and find a simple,fast and convenient method in the process of chitinase purification. This method may also be used in Batch processing. Detailed method is： fermentation supernatant which containing chitinase was first mixed with colloidal chitin, after centrifugation, the chitinase and the colloidal chitin precipitated and separated with other components in the supernatant. Then the precipitated was washed by distilled water for several times, the precipitate was then resuspended in distilled water and then sterilized at 30 ℃ for 72h. After the colloidal chitin was completely hydrolyzed, chitin enzyme was purified and abstracted. This method requires simple, mild purification conditions, ensuring the purified enzyme maintain its biological activity. SDS - PAGE and colorimetry detectingmethods indicated that the recovery rate of chitinase using this method can reach 88.53%.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2011(037)005【总页数】5页(P83-87)【关键词】几丁质酶;胶体几丁质;亲和吸附;离心;纯化【作者】张新军;岳海梅;张伏军;范丽卿【作者单位】西藏农牧学院高原生态研究所,西藏林芝860000;西藏农牧学院植物科学技术学院,西藏林芝860000;金思特科技有限公司,江苏南京210014;西藏农牧学院高原生态研究所,西藏林芝860000【正文语种】中文【中图分类】TS几丁质酶(Chitinase，EC3.2.1.14)是降解几丁质的水解酶，能够催化几丁质水解生成N-乙酰葡糖胺［1］，广泛存在于自然界中，微生物、动物和植物都能产生［2－4］。
产几丁质酶的筛选及活力测定
产几丁质酶的筛选及活力测定一、实验材料1.菌种：白僵菌，或其他菌种及土壤采样等 (菌种接种于PDA斜面上，28℃，80％RH培养14 d后分别置于4℃和20℃备用。
)2.试剂：DNS试剂 :（称取3，5-二硝基水杨酸3．15 g，加水500 mL。
，搅拌5 s，水浴至45。
然后逐步加入100 mL 0．2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。
直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。
再逐步加入四水酒石酸钾钠91．0 g 苯酚2．5 g和无水亚硫酸钠2．5 g。
继续45"C水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL。
用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7 d后可以使用。
)几丁质酶基础培养基(g／L)：葡萄糖5．09，蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，FeS04·2H20 0．1 g，pH 7．0。
几丁质酶诱导培养基(g／L)：蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，ZnS04·7H202 0．01 g，胶体几丁质10 ml，pH 7．0。
（胶体几丁质固体培养基。
g K2HPO4，gKH2PO4， g MgSO4·H2O， g FeSO4·7H2O， gZnSO4·7H2O 500 ml 1%胶体几丁质，500 ml 蒸馏水，15 g 琼脂，，121℃灭菌15 min，冷却至50℃左右倒平板）马铃薯培养基(PDA)；去皮的马铃薯200 g切块，沸水煮30 min，纱布过滤，20 g蔗糖，209琼脂，加热至全部溶解，定容至1 L。
二、筛选·1.初筛采用平板透明圈法。
用0．1 mL孢子悬液(1×107／mL)滴于几丁质平板的中央(每个样品重复3次)，28℃培养7d，其菌落周围有透明圈出现。
几丁质酶的活性改良及固定化研究
几丁质酶的活性改良及固定化研究几丁质酶是一类催化水解几丁质及其衍生物中的β-1,4糖苷键,产生N-乙酰胺基葡萄糖的糖基水解酶。
几丁质被几丁质酶水解后,能产生多种不同聚合度的几丁寡糖。
这些几丁寡糖具有多种生物活性,比如抗细菌和真菌活性,调控机体免疫能力及抗癌等功能。
而且,几丁质酶能破坏植物寄生线虫肠道和病原真菌细胞壁中的几丁质成分。
因此,几丁质酶在医药领域、环保领域和农林业中具有十分广泛的应用价值。
本研究是针对实验室先前克隆的几丁质酶基因pachi,通过易错PCR技术构建pachi基因的随机突变库,采用96深孔板和T7噬菌体结合的高通量筛选技术,以1%可溶性壳聚糖为底物,DNS为指示剂,对随机突变库进行筛选。
从大约12000个突变株中筛选到一株活性明显提高的突变体PachiN35D,与野生型进行氨基酸序列比对发现,突变体的第35位氨基酸残基由原来的天冬酰胺替换成天冬氨酸。
比较分析野生型几丁质酶Pachi和突变体PachiN35D的酶学性质发现,对于可溶性壳聚糖底物,突变体PachiN35D的最适温度为50℃,比野生型Pachi的60℃下降了10℃。
野生型Pachi在60℃水浴1 h后,还能保持76%的活性,而突变体PachiN35D 在55℃水浴1 h后几乎完全丧失活性。
分析野生型和突变体的动力学常数,野生型Pachi的Km是36.1 mg/mL,突变体PachiN35D的Km是13.3 mg/m L,突变体对于可溶性壳聚糖底物的亲和力提高了63%;野生型的kcat/Km值是0.37mL/mg/min,而突变体的kcat/Km值是1.14 mL/mg/min,表明突变体PachiN35D的催化效率比野生型Pachi提高了2.1倍,并且突变体PachiN35D的比活力是49.9U/mg,相比野生型Pachi的22.3 U/mg提高了1.2倍。
将几丁质酶突变体用于秀丽隐杆线虫的生物测定,突变体的半致死浓度LC50为309.6μg/m L,比野生型的387.3μg/m L降低了20%,因此,突变体的杀线虫活性提高了20%。
2023届北京海淀科大附中高三3月份模拟考试生物试题含解析
2023年高考生物模拟试卷注意事项：1．答题前，考生先将自己的姓名、准考证号填写清楚，将条形码准确粘贴在考生信息条形码粘贴区。
2．选择题必须使用2B铅笔填涂；非选择题必须使用0．5毫米黑色字迹的签字笔书写，字体工整、笔迹清楚。
3．请按照题号顺序在各题目的答题区域内作答，超出答题区域书写的答案无效；在草稿纸、试题卷上答题无效。
4．保持卡面清洁，不要折叠，不要弄破、弄皱，不准使用涂改液、修正带、刮纸刀。
一、选择题(本大题共7小题,每小题6分,共42分。
)1．如图为基因型为AaBb的哺乳动物体内某个细胞分裂示意图。
下列相关叙述错误的是（）A．图中基因A与a所在的染色体不是同源染色体B．图示细胞的形成发生在哺乳动物的卵巢中C．图示细胞膜已发生封闭作用，阻止其他精子进入D．图示细胞分裂完成后得到一个受精卵和一个极体2．下列有关细胞生命历程的叙述，正确的是（）A．动物细胞分裂能力的强弱与细胞的寿命呈负相关B．细胞生长使细胞体积增大，提高了物质运输效率C．白细胞比红细胞凋亡速率快，有助于内环境的稳定D．人体正常细胞中不存在与癌变有关的基因3．某二倍体植物（AaBbCcDd）一条染色体上的4个基因的分布和表达如图所示，下列叙述错误的是（不考虑基因突变和染色体畸变）（）A．这4个基因与其等位基因的遗传都遵循分离定律B．酶4与精氨琥珀酸结合后，酶4的形状发生改变C．该二倍体植株自交后代中能产生精氨酸的个体所占比例是3/4D．这4个基因之间能发生基因重组4．如图表示不同浓度的戊二醛对大水榕和香蕉草两种沉水植物呼吸作用影响实验结果图。
下列分析正确的是（）不同浓度戊二醛对大水榕呼吸作用影响不同浓度戊二醛对香蕉草呼吸作用影响A．该实验每组应在温度相同和有光条件下进行B．随着戊二醛浓度升高，两种植物的呼吸速率在上升C．氧气与其他阶段产生的NADPH结合得到产物水D．若纵坐标表示水体pH大小则图中曲线变化趋势相反5．油菜素内酯（BR）是一种天然的植物激素，主要分布在植物伸长生长旺盛的部位，已被国际上誉为第六植物激素。
土壤里的根际菌产几丁质酶的定性检测
土壤里的根际菌产几丁质酶的定性检测1 材料与方法1.1 供试菌株土壤中的根际菌。
1.2 培养基和试剂PDA 培养基; 产酶发酵培养基( g/ L ) :NH4NO3 3 g , KH2PO4 2 g , MgSO4 ·7H2O 0.6 g ,FeSO4·7H2O 0.1 g ,胶体几丁质5 g 粉状几丁质制备,pH:5～6 ;胶体几丁质PDA (g/ L) :马铃薯200g ,葡萄糖20 g ,琼脂17 g ,胶体几丁质2 %粉状几丁质制备;1.3 几丁质酶活性测定1.3.1 根际菌发酵液的制备将根际菌菌株接种到PDA 培养基平板(直径9 cm) 上,在光照恒温恒湿培养箱25 ℃、60 %湿度培养。
按根际菌菌株产酶发酵培养基组分配制液体培养基,以每瓶100 mL分装于250 mL 的摇瓶中,灭菌后备用。
把布满根际菌的平板用灭菌水浸泡3～5 min ,用棉签轻轻刮洗下菌体,用脱脂棉或4 层纱布过滤除去菌体,滤液即为孢子悬浮液。
根据血球记数板法进行计数,每瓶按610mL 孢子量接种5mL ,置于恒温摇床以180 r/ min、27～28 ℃培养一段时间。
将发酵液经4 层纱布过滤,滤液再以10 000r/ min 离心30min,弃去沉淀,得到灭菌的发酵上清液。
1.3.2 胶体几丁质PDA 平板透明圈实验胶体几丁质的制备按胶体几丁质PDA 组分制备培养基,并灭菌倒平板备用。
在平板的中央用直径0.5 cm 的打孔器打孔,无菌操作。
用灭菌枪头吸取40μl 灭菌的发酵上清液(用孔径为0.20 μm 细菌滤器过滤灭菌) 加到孔中,用密封胶带封口,于恒温箱28 ℃保温,一段时间后开始观察透明圈情况胶体。
1.4 几丁质平板透明圈实验:观察可发现,根际菌发酵上清液在胶体几丁质平板上就可出现清晰的透明圈,透明圈的出现说明发酵液中存在催化分解几丁质的几丁质酶,通过胶体几丁质平板透明圈实验能够检测几丁质酶的存在。
几丁质酶活性检测试剂盒说明书__微量法UPLC-MS-4231
几丁质酶活性检测试剂盒说明书注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
微量法货号：UPLC-MS-4231规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体60mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体15mL×1瓶2-8℃保存试剂二液体5mL×1瓶2-8℃保存标准品粉剂×1瓶2-8℃保存溶液的配制：1、试剂一：用前摇匀。
2、标准品：5mg N-乙酰氨基葡萄糖。
临用前加入2.27mL蒸馏水配成10μmol/mL的标准溶液，2-8℃保存两周。
产品说明：几丁质酶要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官（例如乌贼的软骨），以及真菌类的细胞壁中。
而几丁质酶（EC3.2.1.14）可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。
几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与3,5-二硝基水杨酸产生棕红色化合物，在540nm处有特征吸收峰，吸收值增加速率反映了几丁质酶的活性。
Chitin Chitinase N-AcetylglucosamineN-Acetylglucosamine+3,5-Dinitrosalicylic Acid Brownish Red Compound（540nm）注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、研钵/匀浆器、蒸馏水、超声破碎仪。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、组织样本的处理：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心20min，取上清，置于冰上待测。
植物源农药杀虫与抑制几丁质酶活性的测定
3. 2 大蜡螟几丁质酶活性的 测定 根据 牛血清 白蛋白标 准曲线 ( Y = 0. 041 31 X– 0 . 033 56 , R2 = 0 . 999 2) 求出大蜡螟虫匀浆液 中蛋白质含量为 33 . 7 ug /g鲜重。 N - 乙酰 氨基葡萄 糖标准曲线 方程为 Y = 1 . 264X - 0 . 019 3, R 2 = 0. 993 3 , K = 1. 264 。通过测 定 OD 540并 计 算 大 蜡 螟单 位 虫 体 蛋 白 的 几 丁 质 酶 比 活 力。见 表 2。
K ey w ord s : Bo tan ica l P estic ides;
G a ller ia m ellonella ;
Insec tic idal activ ity;
Ch itinase
21 世纪全球农业发展 的一个重要趋势是 更加注重农产品质 量安全性 , 倡导安全 优质 绿色食 品 [ 1, 2] , 从天 然植 物中 提取 杀虫 活性物质防治农林害 虫 , 已成 为研究 热点 , 并对 现代农药 研究具 有重要意义。 几丁质酶 ( chitinase) 可以水解昆 虫体壁 和中肠 中的几 丁质 , 在昆虫变态发育过程中 扮演重 要角色。 几丁质 酶抑制剂 通过抑 制几丁质酶活性干扰 昆虫正常变态发育过程而达到杀虫的目的。 由于动植物机体不含 几丁质 , 故以几丁质酶作为靶标的新型生物 农药具有安全 无害 的优点 [ 3, 4] 。目 前已 筛选 出近 十种 不同 来源 的几丁质酶抑制剂 , 包括 糖类与 肽类几 丁质 酶抑 制剂 [ 4] 。而有 关青蒿叶、 桉树叶、 红树植 物白骨 壤叶来 源的几 丁质酶抑 制剂未 见报道。 大蜡螟 ( G alleria m e llone lla) 属螟 蛾科蜡 螟亚科 , 是养 蜂业的 主要害虫。由于大蜡螟易于人工饲养 , 在农药学上可作为生测试 虫 [ 5] 。本研究以大 蜡螟 为测 试对 象 , 研究 青蒿 叶、 桉树、 红 树植 物白骨壤叶乙醇提取 物对它的毒 杀作用 以及对 虫体几丁 质酶活 性的抑制作用 , 为开发新型安全植物源农药提供参考。
产几丁质酶的筛选及活力测定
产几丁质酶的筛选及活力测定产几丁质酶的筛选及活力测定一、实验材料1.菌种：白僵菌，或其他菌种及土壤采样等(菌种接种于PDA斜面上，28℃，80％RH 培养14 d后分别置于4℃和20℃备用。
)2.试剂：DNS试剂:（称取3，5-二硝基水杨酸3．15 g，加水500 mL。
，搅拌5 s，水浴至45。
然后逐步加入100 mL 0．2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。
直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。
再逐步加入四水酒石酸钾钠91．0 g苯酚2．5 g和无水亚硫酸钠2．5 g。
继续45"C水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL。
用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7 d后可以使用。
) 几丁质酶基础培养基(g／L)：葡萄糖5．09，蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，FeS04·2H20 0．1 g，pH 7．0。
几丁质酶诱导培养基(g／L)：蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，ZnS04·7H202 0．01 g，胶体几丁质10 ml，pH 7．0。
（胶体几丁质固体培养基。
0.5 g K2HPO4，0.5 gKH2PO4，0.5 g MgSO4·H2O，0.1 g FeSO4·7H2O，0.1 gZnSO4·7H2O 500 ml 1%胶体几丁质，500 ml蒸馏水，15 g 琼脂，pH7.2，121℃灭菌15 min，冷却至50℃左右倒平板）马铃薯培养基(PDA)；去皮的马铃薯200 g切块，沸水煮30 min，纱布过滤，20 g蔗糖，209琼脂，加热至全部溶解，定容至1 L。
二、筛选1.初筛采用平板透明圈法。
几丁质酶检测
迪信泰检测平台
几丁质酶检测
几丁质酶（Chitinase）是能够催化几丁质中β-1,4糖苷键水解为N-乙酚寡糖和
葡萄糖的酶系，主要存在于甲壳类动物的外壳与软体动物的器官、真菌类的细胞壁、以及受侵染的高等植物中，具有降解真菌细胞壁抵御真菌侵染的作用，同时其降解产物氨基糖寡糖素在调节动植物细胞代谢中起着重要作用。
迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测几丁质酶的活性变化。
此外，我们还提供其他糖代谢类检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定几丁质酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周。
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）。
2. 相关参数（中英文）。
3. 图片。
4. 原始数据。
5. 几丁质酶活性信息。
迪信泰检测平台可根据需求定制其他物质测定方案，具体可免费咨询技术支持。
几丁质酶抑制检测
平板透明圈法测定几丁质酶抑制率一、实验原理几丁质酶在节肢动物蜕皮过程中发挥了极为重要作用，通过抑制几丁质酶的活性，阻止幼虫和蛹蜕皮起到杀虫作用。
几丁质酶抑制化合物筛选平板含有胶体几丁质和琼脂。
在平板上打孔加入酶液。
几丁质酶能分解平板中的胶体几丁质而产生透明圈。
用相同量的酶液与待测液混合是，与对照相比，透明圈越小表明受抑制程度越高。
二、试剂和仪器1、几丁质酶液：0.5U/ml 几丁质酶溶于磷酸缓冲液中。
2、PBS缓冲液：溶液A Na2HPO4浓度0.2mmol/ml，71.6g Na2HPO4溶于1L蒸馏水中；溶液B NaH2PO4浓度0.2mmol/ml，31.2g NaH2PO4溶于1L蒸馏水中；取A 37.5ml、B 62.5ml混合PH=6.6 4℃保存，一周使用完。
3、几丁质胶配置：取粉状几丁质2g置于烧杯中，加入40ml浓盐酸搅拌，几丁质被浓盐酸溶解成糊状物质，加入200ml去离子水，不断搅拌至乳白色胶体析出，将胶体用200目纱布过滤，倒去滤液。
在胶体中加入200ml去离子水搅拌过滤，重复此步骤至PH﹥5，再用磷酸缓冲液冲洗胶体至中性左右。
4℃密封保存备用。
试验前取出定量胶体几丁质，加去离子水溶解，配置成浓度为0.5%的溶液，进行超声处理，使溶液成为均质絮状胶体溶液。
4、平板配置：取胶态几丁质5g，琼脂粉2g，用蒸馏水定容至100ml，在250ml三角瓶中加热搅拌至沸腾，室温冷却至60℃，摇匀倒平板，冷却至培养基凝固。
三、试验步骤用内径为D=8mm打孔器在制备好的平板上对称打4个孔。
四、计算透明质酸酶抑制率（%）=(D对照- D样品）/ D对照×100%试中：D对照—对照组的透明圈直径D样品—测试组的透明圈直径。
几丁质酶活力测定方法-菲林试剂返滴定法
几丁质酶活力测定方法——菲林试剂返滴定法一、试剂与材料1、斐林试剂：甲液：称取69.3g硫酸铜(CuSO4 5H2O)用蒸馏水溶解，定容至1000ml。
乙液：称取346g酒石酸钾钠，100g氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定容至1000ml。
2、1%次甲基蓝溶液：称取1g次甲基蓝溶解于100ml蒸馏水中，于棕色瓶中储存。
3、标准葡萄糖液：准确称取2g无水葡萄糖(预先于105℃烘2小时左右至恒重)，加水溶解，定容至1000ml。
此为0.2%的标准葡萄糖液。
碱式滴定管、电炉、样品糖液二、操作方法1、斐林试剂的标定：吸取斐林试剂甲、乙液各5ml，置于250ml三角瓶中，加入10ml蒸馏水，并从滴定管中加入0.2%标准葡萄糖液若干毫升，其量应控制在后滴定时(消耗0.2%的标准葡萄糖0.5-1.0ml)。
摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸2min，加2滴1%次甲基蓝溶液，继续用0.2%标准的葡萄糖溶液滴定至蓝色消失为终点。
此滴定操作在1min内完成，记录耗用的0.2%标准葡萄糖溶液体积为V0毫升。
2、定糖预备试验：吸取斐林甲、乙液各5ml，置于250ml三角瓶中，准确加入10ml样品糖液，摇匀于电炉上加热至沸。
加2滴1%次甲基蓝溶液，用0.2%标准葡萄糖液滴定至蓝色消失。
消耗标准葡萄糖液V1毫升。
3、样品中还原糖的测定：准确吸取斐林甲、乙液各5ml,置于 250ml三角瓶中，准确加入10ml样品糖液，补加(V0-V1)毫升蒸馏水，并从滴定管中预先加入(V1-1)毫升0.2%标准葡萄糖液。
摇匀，于电炉上加热至沸，保持微沸2min，加入2滴1%次甲基蓝溶液，继续用0.2%标准葡萄糖滴定至蓝色消失。
此操作在1min内完成。
记录消耗标准葡萄糖液总体积为V毫升。
三、计算还原糖含量(g/ml，以葡萄糖计)=(V0-V)×0.2×0.1×n式中：V0-斐林试剂标定值;V-样品糖液测定值;0.2-标准葡萄糖液浓度;10-样品糖液体积;n-样品稀释倍数。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
几丁质酶活性的测定
⑴几丁质酶
几丁质是绝大多数真菌细胞壁的主要成份，而在植物中却不存在。
但高等植物普遍存在着几丁质酶，并可通过几丁质酶催化几丁质的水解，使植物具有抵御真菌侵染的能力（Shibuya and Minami, 2001）。
在正常情况下，高等植物的几丁质酶表达水平很低，而当植物体遭受到病原真菌、细菌和病毒侵染，机械创伤或乙烯处理时，其表达活性显著增强。
特别是在β-1,3-葡聚糖酶的协同作用下，可明显抑制真菌的生长（Sela-Buurlage et al., 1993）。
几丁质酶是植物体中与防御有关的一种次生水解酶，是植物广谱防御机制的一个成分（V an Loon and Van Strien, 1999），它能催化真菌细胞壁的重要成分——几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物的抗真菌能力。
而植物体中尚未发现几丁质酶作用的底物，所以，几丁质酶在植物体中诱导与积累，对于增强植物的抗病能力有重要作用。
几丁质酶主要水解几丁质多聚体β-1,4键，产生N-乙酰葡聚糖胺寡聚体，水解可以是外切作用也可以是内切作用。
⑵试剂的配制
①胶状几丁质的制备
称取粉末状几丁质（甲壳素，sigma）5.0 g，缓慢加入200 mL （≤4℃）预冷的浓HCl中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，待几丁质粉末均匀分散后，在水浴中轻度搅拌并缓慢加热至37 ℃混合物的粘度迅速增加，几分钟后粘度开始下降，混合物逐渐变得清亮。
当几丁质基本上溶解完毕时，用玻璃棉过滤，将滤液倒入2000 mL预冷（≤4℃）的蒸馏水中，搅拌，几分钟后几丁质沉淀，溶液变得混浊，30分钟后停止搅拌，将悬液置于冰箱(≤4℃)沉淀过夜。
倒掉上清，剩余部分用双层中性滤纸抽滤，沉淀用蒸馏水洗涤数次，待pH达到5以上时，加数滴1 N NaOH使溶液呈中性。
将上述中性沉淀物加到200 mL的蒸馏水中，剧烈搅拌重新悬浮，即为胶体几丁质溶液。
取该溶液5 mL, 105℃烘箱干燥至衡重，测定溶液几丁质的含量（胶体几丁质溶液的几丁质含量为: mg/mL），并将胶体几丁质溶液浓度稀释为1%。
②1%对二甲氨基苯甲醛（1% DMAB）
称取1 g对二甲氨基苯甲醛，加入少量冰醋酸溶解，再加1.25 mL浓HCl，最终用冰醋酸定容至100 mL.（溶液呈黄色）
③饱和硼砂
称取5.0 g四硼酸钠（Na2B4O7·10H2O），溶于100 mL热水中，冷却后备用。
⑶几丁质酶活性的测定
①几丁质酶的提取
称取0.1g水稻叶片，液氮研磨成粉末，加2 mL醋酸提取液（0.05 mol/L，pH5.0），转移入2 mL 离心管，4℃下12000 r/min离心15 min，上清液转移到新的1.5 mL离心管中，4℃冰箱中保存备用。
②外切几丁质酶活性测定
1.2 mL反应混合液中含0.4 mL粗酶提取液、0.4 mL醋酸缓冲液（0.05 mol/L，pH5.0）和0.4 mL 胶体几丁质溶液（1%）。
37 ℃水浴反应2 h后，4000 r/min离心10min，终止反应。
参考Reissig等(1955)的方法测定上清液中的N-乙酰葡萄糖胺量。
方法是取0.4 mL上清液，加0.2 mL饱和硼砂溶液（上清液即刻变黄色），沸水浴7 min，冷却后再加2 mL冰醋酸和1 mL 1%对二甲氨基苯甲醛（DMAB）溶液，37 ℃水浴保温15min后（溶液呈红色），585nm处测定溶液吸光值。
③内切几丁质酶活性测定
取0.4 mL上述上清液，加40 μL 1%蜗牛酶溶液，继续在37 ℃反应30 min，用上述Reissig等(1955)的方法测定产生的N-乙酰葡萄糖胺量，即得总几丁质酶活性。
总几丁质酶活性减去外切几丁质酶活性，即为内切几丁质酶活性。
一个酶活性单位(U)定义为每克鲜植物组织每小时分解胶体几丁质产生1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量。
④N-乙酰葡萄糖胺标准曲线的制备
参考文献：
肖拴锁, 王钧. 水稻中超氧诱导与稻瘟菌抗性及苯丙氨酸解氨酶、几丁酶、β-1,3-葡聚糖酶活性诱导的关系. 中国水稻科学, 1997 (02): 93-102.
Reissig JL, Strominger JL, Leloir LF. A modified colorimetric method for the estimation of N-acetylamino sugars. Journal of Biological Chemistry, 1955, 217: 959-966.
Sela-Buurlage MB, Ponstein AS, Bres-Vloemans SA, Melchers LS, van den Elzen PJM, Cornelissen BJC.
Only specific tobacco (Nicotiana tabacum) chitinases and β-1,3-glucanases exhibit antifungal activity.
Plant Physiology, 1993, 101(3): 857-863.
Shibuya N, Minami E. Oligosaccharide signalling for defence responses in plant. Physiological and Molecular plant pathology, 2001, l59: 223-233.
Van Loon LC, Van Strien EA. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1999, 55(2): 85-97.。