southern印记杂交

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实验步骤
二. 1％琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶，共7个样 1.基因组DNA10 mg 2.酶切样品（1） 3.酶切样品（2） 4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml) 5.酶切样品（1） 6.酶切样品（2） 7.基因组DNA10 mg
实验步骤
基因组DNA经酶切成小片段（EcoR I或 Hind III） 电泳分开各片段（1％琼脂糖凝胶电泳） 变性（双链经碱变性解开成两条单链） 转膜及固定（DNA经毛细管作用转移到尼龙膜上， 紫外交联固定） 预杂交（减少标记探针的非特异性结合， 小分子鲑精DNA为竞争性封闭剂） 杂交（靶DNA单链与DIG标记的c-myc探针之间以 碱基互补的原则进行杂交） 洗膜（洗去未与靶DNA结合的探针） 检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）
Southern blot印迹杂交原理示意图
影响杂交的因素
1）待检核酸分子的浓度和长度
浓度越大,复性速度越快,敏感性↑; 分子越大,转膜越困难,敏感性↓; 转膜方法
2）探针的性质(标记效率、浓度，核酸性质)
对于单链探针,浓度越高,杂交率增加; 探针标记方法和检测方法的选择
3）杂交液体积、温度和杂交时间
实验步骤
六.杂交和洗膜 将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 60℃封 闭6小时。 倒出预杂交液,加杂交液,60℃杂交过夜。 回收杂交液 (可重复使用), 将膜放在洗膜溶 液I中,室温洗2次,每次摇动5分钟。 再在洗膜溶液II中(60℃预热后直接倒进表面 皿),洗2次, 每次摇动15分钟。
实验步骤
七.检测
将膜在缓冲液1中漂洗3分钟。 在缓冲液2中室温摇动封闭30分钟。 在抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟。 用洗膜溶液III洗2次, 每次15分钟。 在缓冲液3中平衡3分钟。 将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温育0.5-16 小时。 当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变深前, 用 TE洗去底物液，干燥保存。
体积越小,杂交动力学越高;
DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃;
温度↓非特异性↑; 温度↑敏感性↓
影响杂交的因素
4）杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+ 的作用) 高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完 全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐 浓度;
5）非特异性杂交反应：预杂交的作用
杂交前封闭膜上非特异性杂交位点,减少其对探针的非特 异吸附
影响杂交的因素
6）杂交后的漂洗：盐浓度、温度、次数，体积 漂洗从低严谨度→高严谨度 7）固相膜的选择
阳离子尼龙膜
预期结果
Southern blot技术优点：
Southern blot方法十分灵敏，在理 想的条件下，用放射性同位素标记 的特异性探针和放射自显影技术， 即便每条电泳带仅含2ng DNA也能 被清晰地检测出来。
Southern杂交技术原理
Southern杂交技术是由Edward M. Southern在 1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交 技术，并因此而得名 根据毛细管作用的原理，将在电泳凝胶中分离的 DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过 与标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，检测 这些被转移的DNA片段。
Southern blot 分子杂交
贾宾 王赛 肖炜恩 查强
Southern分子杂交是核酸杂交的一种
根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA 或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成 双链结构，称之为核酸杂交 将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA进行标记，制 成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列， 或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一 类重要的检测手段 Southern杂交技术（Southern blot）用于检测DNA
实验步骤
整齐地放上草纸，数张草纸一折二，草纸堆要 高出搪瓷盘边约10cm
实验步骤
在草纸上放上玻璃板, 压上约500g重的重物, 转移过夜
实验步骤
五.固定 将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样槽 在尼龙膜上画上槽的位置 正面朝上放在紫外交联仪中（909室），交联 固定 ddH2O稍加漂洗后空气中自然干燥
组
组
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实验步骤
一. 基因组DNA的限制性内切酶酶切
（1） HL60基因组DNA10μg 10×Buffer TANGO+ EcoR I（10 u / μl） 总体积 37℃保温1.5h。 16 μl 2 μl 2 μl 20 μl （2） HL60基因组DNA10μg 10×Buffer R Hind III（10 u / μl） 总体积 16 μl 2 μl 2 μl 20 μl
实验步骤
三.变性 将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢 摇动20分钟。 ddH2O洗2次。 在胶中和液中慢慢摇动15分钟。
实验步骤
四.转移 在搪瓷盘中加入300ml10×SSC，放上培养皿和 小玻璃板
实验步骤
将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移 液管的滚动，赶走气泡
实验步骤
切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上，赶 走滤纸与胶之间的气泡
Hale Waihona Puke Baidu
实验步骤
再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上，同样不能有气 泡，然后放上三张浸湿的滤纸，赶走气泡
实验步骤
紧贴凝胶四周各放一张X光片
实验步骤
小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要 紧贴滤纸，但不能让滤纸移动
实验步骤
用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断保 鲜膜，但不能割破滤纸。取走滤纸上的保鲜膜
注意事项：
1. 膜的大小及预杂交、杂交过程中所用试剂的量可根据需要进行适当 调整。 2．将凝胶中和至中性时，要测pH，防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维素 膜。 3. 要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡。