免疫学检测技术基本原理
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将抗原抗体反应与标记技术相结合，将已 知的抗体或抗原标记上失踪物质，通过检测标 记物，间接测定抗原-抗体复合物的一类试验方 法。
19
常用的标记物：
酶 荧光素 放射性元素 胶体金 化学发光物质等
20
①免疫酶测定法
a) 双抗体夹心法ELISA
a）
b) 间接ELISA
b）
c) BAS—ELISA
利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁
抗原浓度
Ag
Ag
Ag
Ag
16
双向免疫扩散
Ag1 Ag2
Ag3
Ag4
Ab
鉴定多种抗原是完全相同、部 分相同或完全不同，抗原纯度 鉴定
17
免疫电泳
存在于不同区域的抗原 与抗体结合，在比例适宜处 形成沉淀弧。
沉淀弧的数量、位置和 形状与标准品相对比，可分 析样品的成分及其性质。
18
三、免疫标记技术(immunolabeling techniques)
1. 高度特异性 2. 表面化学基团之间的可逆结合（可逆性） 3. 适宜的抗原抗体浓度和比例（比例性） 4.抗原抗体反应的两个阶段
①抗原抗体特异性结合阶段 ②可见反应阶段
3
1.高度特异性
抗原抗体反应物质基础是抗原表位(决定簇)与抗体
CDR的互补结合(相互吻合，具有互补性)。
4
2.表面化学基团之间的可逆结合（可逆性）
21
d）免疫组化技术
定位、定性、定量检测
22
②免疫荧光技术
23
24来自百度文库
③放射免疫测定
用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。 将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来， 具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、 药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。
④化学发光免疫技术
将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种 新的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺。
56℃ 3 .酸碱度 最适pH值在6-8之间
8
第二节 检测抗原或抗体的体外试验
9
一、凝集反应（agglutination reactions)
定义：颗粒性抗原(细菌、细胞等或表面包被抗原 的颗粒)与相应的抗体在电解质存在的条件下结合， 出现肉眼可见的凝集团块现象。
10
包括： 1.直接凝集反应
(direct agglunitation reatctions)
-泛影葡胺)
外周血单个核细胞的分离
30
E花环形成试验
31
淋巴细胞及其亚群的分离
免疫吸附分离法 磁珠分离法
流式细胞术
肽—MHC四聚体技术
32
免疫吸附分离法
anti-CD4 anti-CD4
加入淋巴 细胞悬液
anti-CD4
弃上清
33
磁珠分离法
34
流式细胞术
喷嘴
单细胞悬液 5000-10000个/秒
第二十二章 免疫学检测技术
1
免疫学检测技术的基本原理
体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素
体内：抗原+抗体→免疫反应 体外：抗原+抗体→进行检测
检测抗原或抗体的体外实验(血清学实验）
凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 蛋白质芯片技术
免疫细胞功能的检测 2
第一节 体外抗原抗体反应的特点及影响因素
（一）抗原抗体反应的特点
玻片法：ABO血型鉴定、细菌鉴定 试管法：抗体效价的判定
2.间接凝集反应 (indirect agglunitation reactions)
11
玻片法
直接凝 集反应
试管法
ABO血型鉴定 或菌种鉴定
检测抗体 的滴度或 效价
1:2稀释待测血清 1:4
1:8
1:16
12
间接凝集反应
将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体 上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进 行反应产生凝集，叫做间接凝集反应。
灵敏度高、简便、可实现自动化分析。
25
⑤免疫胶体金技术
1. 用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab的方法。 2. 氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的
疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。 3. 该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。
26
⑥免疫印迹法-Western blotting
抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合。通过非共价键结合。 5
Ag-Ab结合的力
特异性
结合力的表示方法
亲和力和亲合力
Ab
低亲和力
Ag
Ab
Ag
亲和力
高亲和力
低亲合力
高亲合力
亲合力
6
3.适宜的抗原抗体浓度和比例（比例性）
7
（二）抗原抗体反应的影响因素
1.电解质 0.85%氯化钠或各种缓冲液 2 .温度 37℃
荧光抗体标记混合细胞
细胞分选器
荧光
检测器
35
二、免疫细胞功能的测定
T细胞功 B细胞功 能测定 能测定
细胞毒 试验
吞噬功 能测定
细胞因 子检测
T细胞增 殖试验
迟发型超 敏反应的
检测
抗体含 量测定
溶血空 斑试验
51Cr释放法
乳酸脱氢 酶释放法
细胞染 色法
凋亡细胞 检测法
硝基蓝四 氮唑试验
巨噬细胞 吞噬试验
生物活性 检测法
免疫学检 测法
36
T细胞功 能测定
T细胞增 殖试验
T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种 方法检测：
1. 形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核 松散及出现较多核仁；
2. 3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液 体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器， 易有放射性污染。
肽-MHC四聚体技术
B细胞功 能测定
抗体含 量测定 溶血空 斑试验
免疫细胞 功能测定
细胞毒 试验
吞噬功 能测定
51Cr释放法
乳酸脱氢 酶释放法
细胞染 色法
凋亡细胞 检测法
硝基蓝四 氮唑试验
巨噬细胞 吞噬试验
细胞因 子检测
生物活性 检测法 免疫学检
测法
29
一、免疫细胞的分离
稀释 血液
淋巴细胞分
离心
离液(葡聚糖
13
二、沉淀反应（precipitation reactions）
定义： 可溶性抗原与相应抗体在适当电解质存在条件下 结合，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
14
可在液体/半固体琼脂中进行。 包括： 1.单向琼脂扩散（可溶性抗原定量） 2.双向琼脂扩散 3.免疫电泳
15
单向琼脂扩散
用于确定
Ab in gel
27
四、蛋白质芯片技术
又称为蛋白质微阵列，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微阵列。根据 蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。
28
第三节 免疫细胞功能的检测
淋巴细胞及其 亚群的分离
磁珠分离法
T细胞功 能测定
免疫吸附分离法
流式细胞术
T细胞增 殖试验
迟发型超 敏反应的
检测
19
常用的标记物：
酶 荧光素 放射性元素 胶体金 化学发光物质等
20
①免疫酶测定法
a) 双抗体夹心法ELISA
a）
b) 间接ELISA
b）
c) BAS—ELISA
利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁
抗原浓度
Ag
Ag
Ag
Ag
16
双向免疫扩散
Ag1 Ag2
Ag3
Ag4
Ab
鉴定多种抗原是完全相同、部 分相同或完全不同，抗原纯度 鉴定
17
免疫电泳
存在于不同区域的抗原 与抗体结合，在比例适宜处 形成沉淀弧。
沉淀弧的数量、位置和 形状与标准品相对比，可分 析样品的成分及其性质。
18
三、免疫标记技术(immunolabeling techniques)
1. 高度特异性 2. 表面化学基团之间的可逆结合（可逆性） 3. 适宜的抗原抗体浓度和比例（比例性） 4.抗原抗体反应的两个阶段
①抗原抗体特异性结合阶段 ②可见反应阶段
3
1.高度特异性
抗原抗体反应物质基础是抗原表位(决定簇)与抗体
CDR的互补结合(相互吻合，具有互补性)。
4
2.表面化学基团之间的可逆结合（可逆性）
21
d）免疫组化技术
定位、定性、定量检测
22
②免疫荧光技术
23
24来自百度文库
③放射免疫测定
用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。 将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来， 具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、 药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。
④化学发光免疫技术
将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种 新的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺。
56℃ 3 .酸碱度 最适pH值在6-8之间
8
第二节 检测抗原或抗体的体外试验
9
一、凝集反应（agglutination reactions)
定义：颗粒性抗原(细菌、细胞等或表面包被抗原 的颗粒)与相应的抗体在电解质存在的条件下结合， 出现肉眼可见的凝集团块现象。
10
包括： 1.直接凝集反应
(direct agglunitation reatctions)
-泛影葡胺)
外周血单个核细胞的分离
30
E花环形成试验
31
淋巴细胞及其亚群的分离
免疫吸附分离法 磁珠分离法
流式细胞术
肽—MHC四聚体技术
32
免疫吸附分离法
anti-CD4 anti-CD4
加入淋巴 细胞悬液
anti-CD4
弃上清
33
磁珠分离法
34
流式细胞术
喷嘴
单细胞悬液 5000-10000个/秒
第二十二章 免疫学检测技术
1
免疫学检测技术的基本原理
体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素
体内：抗原+抗体→免疫反应 体外：抗原+抗体→进行检测
检测抗原或抗体的体外实验(血清学实验）
凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 蛋白质芯片技术
免疫细胞功能的检测 2
第一节 体外抗原抗体反应的特点及影响因素
（一）抗原抗体反应的特点
玻片法：ABO血型鉴定、细菌鉴定 试管法：抗体效价的判定
2.间接凝集反应 (indirect agglunitation reactions)
11
玻片法
直接凝 集反应
试管法
ABO血型鉴定 或菌种鉴定
检测抗体 的滴度或 效价
1:2稀释待测血清 1:4
1:8
1:16
12
间接凝集反应
将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体 上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进 行反应产生凝集，叫做间接凝集反应。
灵敏度高、简便、可实现自动化分析。
25
⑤免疫胶体金技术
1. 用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab的方法。 2. 氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的
疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。 3. 该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。
26
⑥免疫印迹法-Western blotting
抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合。通过非共价键结合。 5
Ag-Ab结合的力
特异性
结合力的表示方法
亲和力和亲合力
Ab
低亲和力
Ag
Ab
Ag
亲和力
高亲和力
低亲合力
高亲合力
亲合力
6
3.适宜的抗原抗体浓度和比例（比例性）
7
（二）抗原抗体反应的影响因素
1.电解质 0.85%氯化钠或各种缓冲液 2 .温度 37℃
荧光抗体标记混合细胞
细胞分选器
荧光
检测器
35
二、免疫细胞功能的测定
T细胞功 B细胞功 能测定 能测定
细胞毒 试验
吞噬功 能测定
细胞因 子检测
T细胞增 殖试验
迟发型超 敏反应的
检测
抗体含 量测定
溶血空 斑试验
51Cr释放法
乳酸脱氢 酶释放法
细胞染 色法
凋亡细胞 检测法
硝基蓝四 氮唑试验
巨噬细胞 吞噬试验
生物活性 检测法
免疫学检 测法
36
T细胞功 能测定
T细胞增 殖试验
T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种 方法检测：
1. 形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核 松散及出现较多核仁；
2. 3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液 体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器， 易有放射性污染。
肽-MHC四聚体技术
B细胞功 能测定
抗体含 量测定 溶血空 斑试验
免疫细胞 功能测定
细胞毒 试验
吞噬功 能测定
51Cr释放法
乳酸脱氢 酶释放法
细胞染 色法
凋亡细胞 检测法
硝基蓝四 氮唑试验
巨噬细胞 吞噬试验
细胞因 子检测
生物活性 检测法 免疫学检
测法
29
一、免疫细胞的分离
稀释 血液
淋巴细胞分
离心
离液(葡聚糖
13
二、沉淀反应（precipitation reactions）
定义： 可溶性抗原与相应抗体在适当电解质存在条件下 结合，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
14
可在液体/半固体琼脂中进行。 包括： 1.单向琼脂扩散（可溶性抗原定量） 2.双向琼脂扩散 3.免疫电泳
15
单向琼脂扩散
用于确定
Ab in gel
27
四、蛋白质芯片技术
又称为蛋白质微阵列，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微阵列。根据 蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。
28
第三节 免疫细胞功能的检测
淋巴细胞及其 亚群的分离
磁珠分离法
T细胞功 能测定
免疫吸附分离法
流式细胞术
T细胞增 殖试验
迟发型超 敏反应的
检测