益生菌连续传代1000代过程

益生菌在常规培养条件下连续传代1000代过程中稳定性研究

摘要：以益生菌Lactobacillus casei Zhang为研究对象，通过观察该菌株在普通MRS培养基中连续传代1 000代期间细胞形态、菌落形态、活菌数、浊度和菌株活力的变化对其稳定性进行了初步评价。结果表明，L.casei Zhang在1000代期间细胞形态与菌落形态没有发生变化；活菌数、浊度均和菌株活力随培养代数的增加呈现波动性变化，但波动幅度较小，总数基本维持不变。上述研究结果初步表明L. caseiZhang具有良好的稳定性，暗示其可用于产业化生产。

关键词：益生菌；Lactobacillus casei Zhang；连续传代；稳定性

Study on the stability of the probiotic Lactobacillus casei Zhang during continuous subculturing in normal condition for 1000 generations

Abstract: In this study, we selected probiotic Lactobacillus casei Zhang as the research object, and its stability was assessed by monitoring the

change of cell morphology, colony morphology, viable counts, growth (OD

600

) and activity during the 1 000 generations. The results showed

that bacterial cell and colony morphology of L. casei Zhang had no change, and the viable counts, growth and bacterial activity of L. casei

Zhang fluctuated mildly. In a word, L. casei Zhang was stable during long-term contiuous subculturing, which can be further applied in indus-

try.

Key words: Probiotic; L. casei Zhang; Continuous Subculturing; Stability1

16Vol.41，No.11 2013(total 276)

Research Papers

研究报告

引言

益生菌是指通过摄入适当量从而对宿主产生有

益作用的活性微生物，对人体主要具有免疫调节、调

整肠道菌群、防止腹泻、降低粪便中某些酶活性及抗

突变抗癌的医疗保健作用

[1-4]

。通常益生菌都要经过严

格的筛选，还要经过动物实验和人体临床实验的综合

评价

[5-6]

。此外，它们还应具备优良的遗传稳定性能

[7]

。

从微生物应用的角度来看，这也是菌株实现产业化生

产的必备条件。

益生菌Lactobacillus casei Zhang来源于草原蒙古族

几前年流传下来的原生态发酵乳饮料酸马奶

[8]

。经过

多年系统的基础研究，我们自主解决了其产业化的关

键技术问题。本文通过观察该菌株在普通MRS培养基

中连续传代1 000代期间细胞形态、活菌数、浊度和菌

株活力的变化对其稳定性进行了评价，以期为后续试

验提供参考。

1

实验

1.1

材料

1.1.1 菌株来源

益生菌L. casei Zhang原始菌株（0代）是由内蒙古

农业大学提供，LABCC编号IMAU10048。

1.1.2 试剂与仪器

试剂：法国梅里埃合成无糖MRS培养基，纽西兰

超特级脱脂乳粉，葡萄糖、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、琼

脂粉等常用试剂均为国产分析纯试剂。

仪器：NSC-ⅡA-1200无菌工作台，恒温培养箱

（LRH -500F），台式高速冷冻离心机（Eppendorf，5810R型），pH计（SJ-3F型），超纯水系统（MUL- 9000），HITACHI U-2000 型紫外可见分光光度计，HIRAYAMA HA-300M全自动高压灭菌器等。

1.2

实验菌株的连续传代培养及培养代数计算

将0代益生菌L. casei Zhang按体积分数为1%接种

量进行长期连续传代培养至1 000 代。在每个传代周

期（24 h）内，菌体菌数约增长100倍，生长代数约为

6.64代

[9]

。

1.3

细胞形态学观察

在菌株L. casei Zhang连续传代过程中，培养至

1 000 代时对菌株进行革兰氏染色、油镜观察、照相，

观察培养周期末菌株细胞形态。

1.4

生长周期末活菌数变化

在菌株传代过程中，每培养200代测定各个菌株

在培养周期末（24 h）的活菌数。样品经倍比稀释到合适梯度后，采用MRS固体培养基平皿倾注法，37 ℃厌

氧培养72 h后计菌落总数，选取菌落数在30～300之间的平板作为活菌总数测定的指标。

1.5

生长周期末浊度变化

在菌株传代过程中，每培养200代测定连续3天的

培养周期末的培养液浊度。传代培养液用未接菌培养

基适当稀释，采用比浊法于600 nm处测定其浊度。

1.6

菌株活力的测定

在菌株传代过程中，每培养200代测定各个菌株

的菌体产酸活力。各菌株以1×10

7

mL

-1

接种于10 mL灭

菌脱脂乳中，37 °C恒温培养24 h，取出后立即放入冰浴，每样加30 mL蒸馏水稀释后，以酚酞作指示剂，以

浓度为0.1 mol/L的NaOH滴定至微红色30 s不退色为止，记录消耗NaOH的体积以计算出样品中的乳酸浓

度，再换算为活力单位。

1.7

数据处理

采用DPS软件对数据进行方差分析，各项指标均

做3个平行。

2

结果与分析

2.1

细胞形态学观察

形态学观察是微生物研究最基本的方法。 L. casei Zhang 0代和1 000代显微镜照相照片如图1所示。由图1可以看出，L. casei Zhang原始菌株细胞典型形态为呈对或呈链杆状排列。在MRS培养基中连续传代以后，1000代菌株细胞形态没有发生大的变化，与原始菌株

形态基本保持一致。这也许可以说明在常规培养条件

下连续传代培养对细胞形态影响微乎其微。

2.3

生长周期末活菌数

长期传代过程中接种量维持恒定不变，因此生长

周期末活菌数也可以认为是衡量菌株稳定性的窗口。

L. casei Zhang在连续培养1000代期间，不同代数菌株在培养周期末的活菌数变化情况如表1所示。由表1可