美国进境大豆北方茎溃疡病菌的分离与鉴定

美国进境大豆北方茎溃疡病菌的分离与鉴定

张建成,　顾建锋,　徐　瑛,　陈先锋

(浙江宁波出入境检验检疫局　315012)

摘要　在对美国进境大豆检疫过程中,对大豆籽粒和夹带茎秆进行病原真菌的分离培养,使用形态学和分子生物学相结合的方法对可疑菌株进行鉴定,确定该菌为Diaporthe p haseolorum(Cke.&Ell.)Sacc.var.caulivora Athow &Caldwell。该病原菌是进境植物检疫潜在危险性病原真菌,在国内属首次截获。

关键词　大豆北方茎溃疡病菌;　鉴定;　分子生物学

中图分类号　S41-33

Isolation and identif ication of northern stem canker of

soybean from America

Zhang Jiancheng,　Gu Jianfeng,　Xu Y ing,　Chen Xianfeng

(N ingbo Ex it&Ent ry I ns pection and Quarantine B ureau,Zhej iang　315012,China)

Abstract　Diaport he sp.isolated f rom soybean seeds and stems imported f rom USA was identified.Both morpho2 logical and molecular characteristics showed it was Diaporthe phaseolorum(Cke.&Ell.)Sacc.var.caulivora Athow&Caldwell.This is the first report on this f ungus in China and it is a potential dangerous f ungus of soybean. K ey w ords　Diaporthe phaseolorum var.caulivora;　identification;　molecular biology

大豆北方茎溃疡病菌(Di a port he p haseolorum var.cauli vora,DPC)是我国进境植物检疫潜在危险性真菌[1],且被列入新修订的进境植物检疫性病虫杂草A1类检疫名录(未公布)。最先于20世纪40年代后期在美国Iowa州发现,当时病原菌被命名为D.p haseolorum var.bat at atis。随后,At how 和Caldwell将它改名为 D.p haseolorum var. cauli vora。20世纪50年代,北方茎溃疡病在美国中北部地区流行,引起产量损失高达50%。目前分布于美国北部地区、加拿大、意大利、巴西、阿根廷、前南斯拉夫。并且疫区还在不断扩大,是国外大豆生产上的重要病害,经济影响很大[2-3]。

该病菌可通过种子和病残体远距离传播,并且抗逆性很强,病残体在-18℃～-15℃下可存活14个月。目前,我国尚没有DPC发生危害的报道,但是中国大豆生产从北到南在不同气候带都有分布,其中有很多和疫区相似的气候区,一旦该病害传入我国,在适宜的条件下定殖,将对我国的大豆生产产生严重影响。

2004年以来,宁波口岸加大了对进境大豆下脚料的检疫力度,有针对性地对间座壳属(Di a port he,无性态为拟茎点霉属Pomosis)病原菌进行检测。2005年6月,在美国进境的大豆下脚料中截获一病菌,通过形态学和分子生物学相结合的方法对其进行了鉴定,确定其为DPC,初步建立了一套DPC的鉴定方法,这是国内首次截获并报道该病菌,并于2006年初用此方法再次检出该病菌。

1　材料与方法

1.1　材料

美国进境大豆中夹带的豆秆及干瘪的大豆籽粒。

1.2　分离培养

挑取有病斑或褐变等可疑症状的豆秆,使用1%次氯酸钠(NaOCl)对其进行表面消毒30s,灭菌水漂洗3次,置于铺好3层湿润吸水纸的培养皿中, 12h光照,12h黑暗交替,25℃恒温保湿培养,5d 后每天观察。将选取的干瘪的大豆籽粒使用同茎秆相同的表面消毒方法,在PDA培养基上25℃恒温培养,5d后每天观察。将上述方法培养出的真菌菌丝或子实体在PDA平板上分离纯化。

收稿日期:　2006-09-17

1.3　形态鉴定

在L EICA S8APO解剖镜和ZEISS Axioskop40显微镜下观察病原菌在豆秆上形成的子囊壳、子囊和子囊孢子,使用L EICA DFC320数码摄像头配合L EI2 CA Qwin V3软件记录其形态并测量大小。并对PDA平板上的菌落形态,产孢情况进行详细记录。1.4　致病性测定

使用牙签法[4],在苗龄14d的大豆幼苗下胚轴用牙签划一伤口,取菌龄7d的菌落边缘菌块(直径约4mm)覆盖于伤口,用无菌凡士林封闭伤口,接种4株,并用PDA培养基小块作对照。接种后的前72h,在气候箱内保持相对湿度90%以上。

1.5　分子生物学鉴定

1.5.1　总DNA提取采用易润华等的方法[5]。

1.5.2　Pomo sis/Diaport he属特异PCR

参照A W ZHAN G等方法[6],使用1对Pomo2 sis/Diaporthe属特异性引物Phom I和Phom I I扩增分离物总DNA,引物序列为PhomI:5’-GA GCTCGCCACT A GATTTCA GGG-3’,PhomII: 5’-GGCGGCCAACCAAACTCTTGT-3’。引物由上海博亚生物技术有限公司提供合成。以本实验室分离保存的Phomopsis lon gicoll a做阳性对照,以重蒸水做阴性对照。PCR反应总体积50μL,反应体系中各试剂的终浓度为:1×buffer、2.5mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dN TP、引物各50p mol,2.5U Taq聚合酶(Takara,大连)、模板DNA25ng、用dd H2O使终体积达到50μL。使用GeneAmp PCR System9700PCR仪(AB I公司)进行PCR反应,反应过程为96℃热变性3min;然后进行40个循环,每个循环95℃变性0.5min、60℃退火0.5min、72℃延伸1min;最后72℃延伸7min。

1.5.3　ITS区PCR

用真菌通用引物ITS4和ITS5扩增总DNA,由上海博亚生物技术有限公司合成(ITS4:5’-TC2 CTCC GC T TA T T GA TA T GC-3’,ITS5:5’-GGAA GTAAAA GTC GTAACAA GG-3’)。反应体系同Phomopsis属特异PCR体系。使用Gene2 Amp PCR System9700PCR仪(AB I公司)进行PCR反应,反应过程为96℃热变性3min;然后进行35个循环,每个循环94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸2min;最后72℃延伸7min。

1.5.4　DNA测序

ITS区PCR产物经纯化后直接用于测序,DNA测序由上海生工生物工程科技有限公司完成,使用ABI 3700测序仪,采用双脱氧测序法,测序引物为ITS4和ITS5,进行双向测序。校对测序结果并拼接序列。

1.5.5　RFL P分析

ITS区PCR产物使用限制性内切酶A l u I, Rsa I,H ha I,Mse I和S cr FI(Takara,大连)进行酶切,按照每种酶的说明书,将1.0μL限制性内切酶, 1.5μL10×buffer,6μL PCR产物,6.5μL dd H2O 混合,在每种酶的适宜酶切温度下孵育3h。PCR 酶切产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳,根据Marker 判断DNA片段大小。

1.5.6　数据分析

测序后的序列经校正后,在核酸序列数据库GenBank中进行同源序列搜索(BL AST搜索),比较测试菌株同现有数据库中相应序列的相似程度。在GenBank上选取同属的代表性菌株,并以Gaeu2 m annom yces g rami nis做为序列分析的外群[7]。利用ClustalX1.8.1进行序列比对,通过M EGA3.1软件选用K imura22parameter距离模型进行U P G2 MA分析生成系统发育树,发育树用自展(Boot2 st rap)分析法进行检验,循环1000次。

2　结果与分析

2.1　形态描述

保湿培养14d后,肉眼可见灰褐色豆秆上生出大量黑色的突起(图1a),为病菌的子囊壳喙。子囊壳后期溢出一条条白色须状的孢子角。子囊壳黑色、球形,单生或2～12个丛生,直径(165～340)μm ×(282～412)μm,埋生于豆秆表皮中。喙表面光滑,喙长180～336μm,宽75～110μm,喙宽度均匀,顶部钝圆。子囊(5.6～5.8)μm×(25.7～27.8)μm,长棍棒状,壁薄,易消解,顶部有清晰的折光环。子囊孢子(2.3～2.5)μm×(8.1～8.4)μm,透明,纺锤形,双细胞,分隔处略缢缩,常含油球。

同时PDA平板上培养的带病种子生白色絮状霉层,挑取纯培养。两种方法得到的纯培养菌株都性状相似,在PDA培养基上20～25℃下生长良好, 7d后长满培养皿,菌落白色,丛生絮状长毛,后期菌落颜色无变化,只在培养基背面有黄色素产生。28d后,子囊壳在不发达的小子座上形成。子囊形状大小与大豆茎秆、种子分离物相似。未见分生孢子器及分生孢子。

?

5

1

?

调查研究

PLAN T PRO TECTION　Vol.33No.2(2007)

图1　大豆北方茎溃疡病菌培养物形态

2.2　致病性测定

两种分离物分别接种大豆幼苗。伤口接种7d 后可见创口边缘呈褐色,且延伸状扩展,整株枯萎,4株大豆幼苗都发病死亡,对照仅在伤口处有破损。剪取接种点上下部茎秆,经表面消毒后用PDA 培养基分离,获得纯培养,其菌落特征、子囊孢子形态大小与豆秆及带病种子原始分离物纯培养一致。2.3　分子生物学鉴定

使用Phomopsis 属特异性引物Phom Ⅰ和Phom Ⅱ扩增阳性对照P.lon gicoll a 和待测菌株,

得到1条300bp 左右的特异性条带,如图2,和报道的337bp 条带大小基本吻合[6]。

使用5种限制性内切酶对ITS 区扩增产物进行酶切,得到酶切图谱如图3。5种限制性内切酶有不同的酶切位点,根据Marker 可以判断出酶切片段的大小范围。文献报道,DPC 的PCR 产物长度600bp 左右,酶RsaI 没有酶切位点,其他4种酶切产物的特征片段长度分别是:A l u I ,281bp 、176bp ;第3条为145bp 或146bp ;H ha I ,260bp 和226bp ;还有一类菌株是228bp 和134bp ;Mse I ,484bp ;S cr FI ,254bp 和96bp [8]。对比研究菌株的酶切图谱,可以

初步判定与报道的DPC 病菌酶切结果相似

。

图2　Phomopsis

属特异性引物扩增结果

图3　大豆北方茎溃疡病菌PCR 2RF LP 酶切图谱

两种来源的分离物的ITS 区PCR 扩增产物经测序比对,发现碱基序列完全相同,共有601bp 。序列在GenBank 上进行BL AST 搜索,经比对分析,所检测的样品的序列同Zhang 等人报道的D.p hase 2

olorum var.cauli vora 菌株713的序列(A F000567)完全相同;与其他两种被鉴定为DPC 的序列(A F000563,A F000212)都仅有1个碱基的差异,相似度也达到99%。聚类树说明测试菌株与其他两个DPC 菌株成为一组的支持率相当高。

根据分离菌株的子囊及子囊孢子的形态特征能够鉴定到Diaporthe 属,同时由该菌株能够使大豆幼苗致病,是大豆上的一种寄生菌,结合进境大豆常见病原真菌的特征,可以初步判定该菌株属于Dia 2

porthe phaseolorum ,根据文献报道

[9]

,由子囊着生特

征、子囊孢子大小可以判断接近于DPC 。分子生物学方法结果表明该菌株属于Pomosis/Diaporthe 属。PCR 2RFLP 分析表明与DPC 酶切图谱非常相似。ITS

保守区的基因分析表明此种真菌在序列上与DPC 的一个菌株完全相同,与Pomosis 属其他种的遗传距离较远,所以可以判定此种真菌是DPC 的一个菌株。

Template.本次研究的菌株;其余序列左边是GenBank中的登记号,右面对应其种类

图4　基于ITS rDNA序列经UPG MA检测的系统发育树(分支上的数字代表1000次自举检测支持率)

3　讨论

大豆北方茎溃疡病病原菌属于子囊菌门、球壳目、间座壳科、间座壳属,无性阶段为拟茎点霉属。在美国、阿根廷等国大豆生产上,能与大豆茎荚枯腐病菌(大豆黑点病菌)(D.phaseolorum var.soj ae)(DPS)、大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla)、大豆南方茎溃疡病菌(D.phaseolorum var.meri dionalis)(DPM)共同引起间座壳-拟茎点综合症(Diaporthe2Phomopsis com2 plex),危害超过其中任何单一真菌病害[9]。除DPS外的其余3种病菌在我国未见报道。

近年来,从美国、巴西、阿根廷等国进境的大豆逐年增加,2005年海关统计数据达到2659万t。本试验证明不但大豆籽粒能够携带病菌,大豆茎秆等大豆下脚料也可以成为带菌载体。而所有进境大豆中都携带着大量豆秆、豆荚、土块、各类杂草籽等杂质。如果对进境大豆的检测能力不足,对大豆加工厂的监管不严,很可能造成各类危险性有害生物的扩散和危害。因此,必须加强对大豆危险性有害生物检测和鉴定方法的研究,尽快在各口岸推广。另外还要进一步加强对各大豆加工厂的检疫监管,对下脚料进行无害化处理,严防有害病菌入侵。

笔者曾于2004年3月从美国大豆秆中检出P. longicolla,由于该病菌未发现有性阶段,分生孢子器表面较粗糙,茎秆保湿培养分生孢子产生时期较早,较容易与其他3种病菌区分。DPS的子囊和子囊孢子明显较大,也较容易区分。DPC与DPM很接近,子囊和子囊孢子差异不大。有报道称DPM子囊壳散生,喙宽100μm左右,菌落老熟后呈褐色;而DPC子囊壳丛生,喙宽60μm左右,菌落老熟后仍呈白色[9]。但在实际鉴定过程中,大豆茎秆上的DPC也有密集和散生的情况,喙的长宽也因不同菌株而有差异,子囊、子囊孢子的大小也有不同。近年来,利用病原菌核糖体ITS(internal transcribed spacer)区域进行病害诊断技术得到重视与应用。病原真菌ITS区具有相对保守性,同时又在属、种水平上有特异性序列差异,可以通过对ITS区进行PCR扩增,测序及序列比对分析后确认病原物归属。同时,随着DNA测序技术的不断成熟,测序需要的费用在不断降低,而时间在不断缩短。病原真菌通过在G enbank比对基因保守区测序结果,结合形态学检测结果和致病性鉴定结果,鉴定到菌株所属种的方法已经趋向成熟。

通过大豆病原真菌的更多检出与标准菌株的积累,可以在ITS区序列基础上设计特异性引物,直接从大豆种子和豆秆上检测区分大豆上的各种检疫性病原物,以满足口岸检测准确、快速的要求。

参考文献

[1]　吴品姗,严进.值得关注的大豆新病害[J].植物检疫,2003,

17(4):226-228.

[2]　BACKMAN P A,WEAV ER D B,MOR GAN2J ON ES G.Soy2

bean stem canker:an emerging disease problem[J].Plant Dis2 ease,1985,69(8):641-647.

[3]　PIOL I R N,MORANDI E N,MAR TIN EZ M C,et al.Mor2

phologic,molecular and pat hogenic characterization of Dia2 port he p haseolorum variability in t he core soybean producing area of Argentina[J].Phytopat hology,2003,93:136-140. [4]　KEEL IN G B L.A seeding test for resistance to soybean stem

canker caused by Diaport he p haseolorum var.caulivora[J].

Phytopat hology,1982,72:807-809.

[5]　易润华,朱西儒,周而勋.简化CTAB法快速微量提取丝状真菌

DNA[J].湛江海洋大学学报,2003,23(6):72-73.

[6]　ZHAN G A W,HAR TMAN G L,RICCIONI L,et ing

PCR to distinguish Di aport he p haseolorum and Phomopsis longicolla from other soybean fungal pathogens and to detect them in soybean tissues[J].Plant Disease,1997,81:1143-1149.

[7]　FARR D F,CASTL EBU R Y L A,ROSSMAN A Y.Morpho2

logical and molecular characterization of Phomopsis vacci nii and additional isolates of Phomopsis from blueberry and cranberry in the eastern United States[J].Mycologia,2002,94:494-504.

?

7

1

?

调查研究

PLAN T PRO TECTION　Vol.33No.2(2007)

[8]　ZHAN G A W ,RICCIONI L ,PEDERSEN W L ,et al.Molecu 2

lar identification and phylogenetic grouping of

Diaport he

phaseolorum and Phomopsis longicolla isolates from soybean

[J ].Phytopat hology ,1998,88:1306-1314.

[9]　HARTMAN G L ,SINCLAIR J B ,RUPE J pendium of

S oybean Disease (4th Edition )[M].Minnesota :APS Press ,1999.

收稿日期:　2006-08-08

3致谢:　本文昆虫学名由浙江大学徐志宏教授鉴定。

双斑锦天牛的生物学特性及防治

3

余黎红,　陈国利,　刘国军

(浙江省常山县林业局　324200)

摘要　双斑锦天牛[A calole pta subl usca (Thomson )]在常山县危害大叶黄杨,1年发生1代,以老熟幼虫在受害植株蛀道中越冬,4月上旬至6月中旬化蛹,5月上旬至7月上旬成虫羽化,5月上旬雌成虫开始产卵,5月中旬幼虫孵化,11月幼虫停止取食进入越冬。根据其生活习性提出了综合防治措施,取得了较好的防治效果。关键词　双斑锦天牛;　生物学特性;　防治措施中图分类号　S 433.5

Bionomics and control of Acalole pt a subl usca

Yu Lihong ,　Chen Guoli ,　Liu Guojun

(Changshan Forest ry B ureau of Zhej iang Province ,　324200,China )

Abstract Only one generation of Acalolepta sublusca (Thomson )occurred in a year in Changshan ,Zhejiang Province ,and it overwintered as old larvae in the tunnels of the trunks.The overwintering larvae pupated from early April to mid 2J une.The adults emerged from early May to early J uly.The females began to lay eggs in early May.The larvae appeared in mid 2May.Integrated control measures were taken against the pest and best results have been achieved.K ey w ords A calole pta subl usca (Thomson );　bionomics ;　control measures

大叶黄杨系常绿灌木,是城镇园林绿化的主要树种之一,常制作成绿篱和绣球。常山县大叶黄杨受双斑锦天牛危害严重,作者通过野外调查和套罩定点观察相结合的方法初步明确双斑锦天牛的生物学特性,并进行了防治试验。

1　寄主和危害

双斑锦天牛[A calolept a subl usca (Thomson )]属鞘翅目天牛科沟胫天牛亚科沟胫天牛属,分布于陕西、北京、山东、上海、江苏、浙江、江西、福建、四川、湖南、贵州等地,危害冬青卫矛、大叶黄杨和算盘子。在常山县双斑锦天牛严重危害大叶黄杨,发生面积667hm 2,县城、公园、320国道常山段两侧以及许多乡镇的大叶黄杨绿化带有虫株率高达60%,致死株率达30%以上,主要以幼虫蛀食树根和干基造成植株枯死。受害初期大叶黄杨树叶失水失绿,之后逐渐枝枯叶黄,根部腐烂。成虫也造成一定的危

害,其补充营养时啃食嫩梢枝干,易致嫩梢折断而枯死。成虫通过连续迁飞扩散危害,速度较快,危害性大,是国家林业局公布的林业有害生物之一。

2　形态特征

2.1　成虫

体长11～23mm ,宽5～7.5mm ,体棕褐色或栗褐色,体表密被灰褐色丝光绒毛。鞘翅密被浅灰色光亮的绒毛,头正中有一条细纵线,额平坦,宽胜于长。♂虫触角长为体长的1.5～2.0倍,♀虫触角仅超过体长的1/2倍,自第3节起,每节基部2/3被稀少灰色绒毛。前胸背板较宽,宽胜于长,侧刺突短小,基部粗大。鞘翅基部宽,向末端渐收缩,端部圆形,两鞘翅基部外缘各有1近圆形的黑褐色斑,肩侧缘有1黑褐小斑,鞘翅末端2/3处有1条棕褐色宽斜带,两鞘翅上的斜带连接成近M 形,鞘翅完全覆盖腹部。3对足的胫节一侧灰褐色,另一侧浅灰色。