实时荧光定量PCR端粒酶检测试剂盒小鼠

实时荧光定量PCR端粒酶检测试剂盒(小鼠)

修订日期：2016.07.22 Cat Number：KGA1028M-KGA1029M

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For Research Use Only(科研专用)

一、试剂盒说明

产品概述：

端粒是真核生物染色体末端特殊的DNA-蛋白结构，含多个重复序列（5’-TTAGGG-3’），端粒结构的形成和功能的维持需要端粒结合蛋白的直接或间接参与。端粒酶是细胞体内一种核糖核蛋白复合体，是由RNA和蛋白质亚基组成的一种特殊的逆转录酶，其可以利用自身的RNA模板合成末端DNA，并添加到染色体末端以克服末端序列的丢失，从而使细胞获得增殖能力。

端粒酶蛋白催化亚基（TERT或TRT）具有反转录酶的主要特征，其表达在正常细胞中受到抑制，研究表明，TERT 或TRT的表达与端粒酶活性的表达一致，与端粒酶的活化程度密切相关。Wisman等在人卵巢癌中利用逆转录PCR检测hTERT的mRNA的表达，并采用TRAP法检测端粒酶活性，结果证实二者均存在于恶性肿瘤中并且表达模式相同。基于上述原理，凯基实时荧光定量PCR端粒酶检测试剂盒通过检测TERT的mRNA表达水平来间接反应端粒酶的活性。

实时荧光定量PCR（SYBR Green Real-time PCR）方法以其卓越的快速性及定量性被广泛应用于科研领域，使用本试剂盒可以准确简便地进行mRNA的表达分析。试剂盒采用SYBR Green qPCR Master Mix为荧光实时定量PCR和Two-Step荧光实时定量PCR设计的最优反应体系，并结合特异性的细胞端粒酶催化亚基基因TERT引物，简化实验步骤和提高实验效率。Master Mix含有Maxima Hot Start Taq DNA聚合酶、dNTPS、进行优化处理的PCR反应缓冲液以及SYBR Green染料。使用Hot Start Taq DNA聚合酶，为PCR反应提供了更高的产量和灵敏度、特异性，能够检测低至10个拷贝的目的基因。

本试剂盒可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对细胞基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。只需加入样品DNA模板，反应即可进行。

2.应用仪器：

适应于大多数的Real-time PCR扩增仪，包括Applied Biosystems，Eppendorf，Corbett，Bio-Rad，Roche，杭州博日（Line-GeneBioer）等品牌的PCR扩增仪。

二、试剂盒组份

组份KGA1028M

20tests KGA1029M

50tests

保存条件

Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（2×）250μL700μL-20℃，避光Water,nuclease-free300μL800μL

TERT-F Primer（10μM）30μL70μL

TERT-R Primer（10μM）30μL70μL

GAPDH-F Primer（10μM）30μL70μL

GAPDH-R Primer（10μM）30μL70μL

三、实验内容：

1.操作步骤：

1).提取样本RNA，并进行逆转录获得cDNA。（可参考凯基RNA提取以及逆转录试剂盒）

2).试剂溶解后，轻轻混匀并低速离心。

3).进行25μL体系的实时定量PCR请参考以下表格（DNA模板下一步中添加）：

Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（2×）12.5μL

TERT-F/TERT-R Primer（10μM）0.6~0.8μM

GAPDH-F/GAPDH-R Primer（10μM）0.6~0.8μM

Template DNA﹤500ng

Water,Nuclease-free to25μL

备注：

a.体系中含有的MgCl2终浓度为2.5mM。

b.大多数体系中引物终浓度为0.3μM可以得到好的实验结果，如有调整，建议引物的最终浓度范围在0.05μM到

0.9μM。

c.体系特殊要求，可以按照该体系进行调整。

4).将以上各组分（除DNA模板外）添加并混匀，加入至PCR反应管或反应板中。

5).添加DNA模板（≦500ng/反应）到第3步骤中准备好的PCR反应管或PCR板中。

备注：在两步法实时定量PCR中，加入的cDNA模板的体积不能超过反应总体积的10%。

6).轻轻的混匀PCR管中的各组分，避免产生气泡，如需要，可进行低速离心。如果有气泡的存在会影响荧光强度

的收集。

7).参照一下说明设置实时定量PCR循环仪，放入样品并启动程序。（如有需要，可以根据仪器本身特点进行调整）2.循环参数设置：

循环反应可以采用三步法或两步法进行实验，参考数据如下：

1).三步法循环参数设置：

阶段温度（℃）时间循环数（可选）UDG预处理502min1

总变性9510min1

变性9515s

复性6030s

40

延伸7230s

备注：荧光信号的收集和处理是在延伸阶段。

2).两步法循环参数设置

阶段温度（℃）时间循环数（可选）UDG预处理502min1

总变性9510min1

变性9515s

40

复性/延伸6060s

备注：荧光信号的收集和处理是在延伸阶段

3.可选步骤：

1).UDG预处理：如需减少PCR产物的污染，可以于总变性前用UDG预处理2min。

2).熔解曲线分析：可用于验证引物设计的特异性以及鉴定PCR产物。如果引物设计不够优化，可能会产生部分

的引物二聚体，这些引物二聚体可以通过熔解曲线观测到。

3).PCR产物的琼脂糖电泳：可以通过琼脂糖电泳的方式对PCR产物进行进一步的验证。

4.备注：

1).建议采用25μL的实验体系，如果改变请参照其余说明进行调整。