7实验七 大鼠肝S9的制备
211133775_灵芝菌丝毒理学安全性评价研究
分析检测灵芝菌丝毒理学安全性评价研究孙国强1，董金颖1，曹发昊2（1.山西瑞芝生物科技有限公司，山西运城 044000；2.运城学院，山西运城 044000）摘 要：目的：对灵芝菌丝的食用安全性进行毒理学评价研究。
方法：依照国家相关标准和规定，首先采用最大耐受剂量法开展大、小鼠急性经口毒性试验，然后开展遗传毒性试验，最后以5.00 g·kg-1、2.50 g·kg-1、1.25 g·kg-1 3个剂量开展大鼠30 d喂养实验，观察大鼠体重、进食量及血常规等的变化，评价其毒理学安全性。
结果：以5.00 g·kg-1最大给药量的样品灌胃，未出现中毒症状，也无死亡；3项遗传毒性试验的结果也均为阴性；与对照组相比，30 d喂养试验发现各个剂量组的大鼠各项指标差异均不具有统计学意义（P＞0.05）。
结论：灵芝菌丝是无毒、无遗传毒性产品，可被开发为供消费者食用的产品。
关键词：灵芝菌丝；毒理学；安全性评价The Toxicological Safety Evaluation of Ganoderma lucidumMyceliumSUN Guoqiang1, DONG Jinying1, CAO Fahao2(1.Shanxi Ruizhi Biotechnology Co., Ltd., Y uncheng 044000, China; 2.Y uncheng University, Y uncheng 044000, China)Abstract: Objective: To conduct a toxicological evaluation study on the food safety of Ganoderma lucidum mycelium. Method: In accordance with national standards and regulations, the acute oral toxicity test in rats and mice was firstly carried out by the maximum tolerated dose method, then the genotoxicity test was carried out, and finally the 30-days feeding experiment in rats was carried out at 3 doses of 5.00 g·kg-1, 2.50 g·kg-1 and 1.25 g·kg-1 to observe the changes in body weight, food intake and blood, and to evaluate the toxicological safety of Ganoderma lucidum mycelium. Result: No toxic symptoms and no death occurred when the sample was gavaged at the maximum dose of 5.00 g·kg-1; the results of the three genotoxicity tests were also negative; compared with the control group, the differences in the indexes of the rats in each dose group were not statistically significant in the 30-days feeding test (P ＞0.05). Conclusion: Ganoderma lucidum mycelium is a non-toxic, non-genotoxic product that can be developed as a product for consumer consumption.Keywords:Ganoderma lucidum mycelium; toxicology; safety assessment灵芝（Ganoderma lucidum）也叫瑞草、仙草等，为名贵的药用真菌[1]。
第二次理论课-特殊毒性试验
适用受试物
提出预期临床用药期至少连续6个月的药物 某些药物存在潜在致癌的担忧因素 当抗肿瘤药物拟用于非带瘤患者的辅助治疗或非肿瘤适应 证长期使用时
对于化合物改盐、改酸根或碱基的情况，若已有原化合 物致癌试验数据，应提供其与原化合物比较的药代动力学、 药效学或毒性等方面无明显改变的证据。 当药物暴露量和毒性发生变化时，可能需进行桥接研究 来确定是否需要进行新的致癌试验。 对于酯类和络合衍生物，上述类似数据对考虑是否需进 行新的致癌试验是有价值的，应根据具体情况具体分析。
氨基喋呤 50μg 大鼠 100μg
氨甲喋呤 42μg 大鼠 200μg
乙烯雌酚 20-80μg 恒河猴 200μg
苯妥英钠 2mg
小鼠 50mg
人与动物比值
5-2.5 2 4.8 10-2.5
25
药物特殊毒性研究
内容：
遗传毒性 致癌作用 生殖和发育毒性 药物依赖性
药物的遗传毒性
注意：
– 1.对Giemsa染色中获得可疑阳性或弱阳性结果的药物， 必须用荧光染色以进一步肯定或否定阳性结果
– 2.不易通过骨髓屏障的药物，可补充用哺乳动物胎肝细 胞微核试验进一步研究
– 3.如遇阳性或可疑阳性时，可选择UDS试验或SOS显 色试验
药物特殊毒性研究
内容：
遗传毒性 致癌作用 生殖和发育毒性 药物依赖性
致癌试验
致癌试验的目的
是考察药物在动物体内的潜在致癌作用，从而评价和预测其可能对人 造成的危害。
任何体外实验、动物毒性试验和人体应用中出现的潜在致癌性因素均可提示 是否需要进行致癌试验。
由于致癌试验耗费大量时间和动物资源，只有当确实需要通过动物长期给药研 究评价人体中药物暴露所致的潜在致癌性时，才应进行致癌试验。
S9代谢活化酶系统制备及蛋白含量的测定
S9代谢活化酶系统制备及蛋白含量的测定何黎黎;杨立开;邓黎;龚涛;孙迅;张志荣【摘要】目的:研究有效的S9代谢活化酶系统的制备方法. 方法:采用苯巴比妥钠作为诱导剂制备大鼠肝S9, 并采用Lowry法测定所制备的S9蛋白含量. 结果:成功制得大鼠肝S9, 并测定其蛋白含量为38.66mg/ml. 结论:苯巴比妥钠作为诱导剂可以成功制备出大鼠肝S9.【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(036)002【总页数】3页(P243-245)【关键词】S9制备;蛋白含量测定【作者】何黎黎;杨立开;邓黎;龚涛;孙迅;张志荣【作者单位】西南民族大学化学与环境保护工程学院,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041【正文语种】中文【中图分类】R9许多致癌剂的生物转化是依赖细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的. 大鼠肝S9(Hepatic post-mitochondrial supernatant)是许多体外实验常用的体外活化系统, 其主要有效成分为混合功能氧化酶(mixed function oxidase , MPO) 系统, 其中许多酶共同组成电子传递体系, 其中细胞色素P450(CYP450)在整个酶系中起着末端氧化酶作用, 具有活化氧分子和与底物结合的双重功能. CYP450在氧化活动和底物结合中的作用决定其在MPO系统中起决定作用[1], 苯巴比妥钠是目前大鼠肝S9常用的诱导剂[2,3], 能诱导活化许多致癌性化学物所需要的细胞色素. 因此, 本文采用苯巴比妥钠作为诱导剂, 制备S9, 并采用Lowry法测定所制备的S9的蛋白含量,进而研究有效的S9代谢活化酶系统制备方法和测定方法.1.1 药品与试剂KCl(分析纯), 苯巴比妥钠(分析纯), MgCl2 6 H2O(分析纯)PBS缓冲液(自配), 6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate, Sigma, 美国), 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶Ⅱ, nicotinamide -adenine dinucleotide phosphate, NADP, Sigma, 美国), Lowry法蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)1.2 仪器冷冻高速离心机(Beckman, AllegraTMX-22R, 美国)；紫外可见分光光度计() 1.3 实验动物Sprague –Dawley大鼠, 雄性, 体重约200g/只(四川大学华西动物实验中心)2.1 肝酶系统的诱导用苯巴比妥钠诱导制备大鼠肝脏S9[2,4]. 将苯巴比妥钠用生理盐水配置成10mg/ml的溶液. 选用体重约200克的Sprague –Dawley雄性大鼠腹腔注射苯巴比妥钠溶液80mg/kg(每日一次), 连续给药三日. 于第四日断颈处死.2.2 大鼠肝S9的制备取采用苯巴比妥钠诱导大鼠, 处死后立即无菌条件下冲洗并取出肝脏. 立即用4℃含有1.15% of KCl 的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)灌洗肝脏. 再按3 ml/g 湿重的比例加入含有1.15% of KCl 的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)于冰浴中匀浆. 合并匀浆, 并于冷冻高速离心机中9000×g离心30min, 取其上清液即为S9. 蛋白质含量按 Lowry 法测定. 测定合格者, 用离心管分装为1.0ml/管, -80℃冰箱中保存, 在实验使用前将冷冻的S9 缓慢融化. 将1 ml S9, 0.33 ml 1 M KCl, 0.32 ml 0.25 M MgCl2 6 H2O, 0.25 ml 0.2 M 6-磷酸葡萄糖, 1 ml 0.04 M NADP, 2.10 ml去离子水和5 ml 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)配制成代谢酶活化系统[5,6].2.3 Lowry法测定S9中蛋白含量2.3.1 标准曲线的绘制取6个带盖的1.5 ml离心管, 编好号后, 按下表顺序加入试剂：每管加入碱性铜试剂工作液后需立即混匀, 20～25℃放置10min后加入Folin-酚试剂, 混匀后, 20～25℃放置30min后在660nm下比色测定(1ml比色杯, 1cm光径测定). 以蛋白含量(μg/μl)为横坐标, 吸光值为纵坐标, 绘出标准曲线；2.3.2 自制S9样品的蛋白浓度测定分别取3份分装后的大鼠肝S9样品, 生理盐水稀释100倍, 取样品稀释液总体积为200μl, 加入碱性铜试剂工作液1000μl, 充分混匀, 置20～25℃水浴保温10分钟后, 加入1N Folin-酚试剂100μl, 20～250C放置30min后, 以标准曲线0号管做参比, 在660nm波长下比色, 记录吸光值. 根据所测样品的吸光值, 在标准曲线上即可查得相应的蛋白质含量(μg/μl), 乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度.3.1 Lowry法测定蛋白含量的标准曲线按照lowry法, 采用蛋白质标准工作液进行测定, 将蛋白含量对紫外可见吸收值(OD)作图, 得到标准曲线, OD=0.7662×C+0.0086, R2=0.9928, 线性关系良好, 线性范围为：0.1mg/ml-0.5mg/ml.3.2 自制大鼠肝S9蛋白质含量的测定根据3份自制大鼠肝S9稀释液测得的平均吸光度(OD值), 带入蛋白含量测定标准曲线, 即可求得平均蛋白含量. 测得所制备的大鼠肝S9平均蛋白含量为38.66mg/ml.在制备S9混悬液过程中, 应注意用新鲜冰冷的0.15 mol/l氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次,以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白. 所制备得到的S9应测定蛋白浓度[1,2], 本实验应用Lowry法测定大鼠肝S9 蛋白浓度, 其显色原理为Folin酚试剂与蛋白质的酷氨酸和色氨酸残基反应显蓝色, 可采用紫外分光光度法测定吸收值测定.【相关文献】[1] 王亚其, 李宏霞, 肖凯, 等. 两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒性试验中活性比较[J]. 现代预防医学, 2006, 33(4):457-459.[2] FABIANI R, ROSIGNOLI P, BARTOLOMEO AD, et al. DNA-damaging ability of isoprene and isoprene mono-epoxide (EPOX I) in human cells evaluated with the comet assay[J]. Mutat Res, 2007, 629: 7-13.[3] 程培英, 曲桂娟, 马红霞, 董晓庆. 苷肽注射液对鼠致突变作用的研究[J]. 吉林农业大学学报, 2007, 29 (3) :334-337.[4] AARON CS, BOLCSFOLDI G, GLATT HR, et al. Mammalian cell gene mutation assays working group report[J]. Mutat Res, 1994, 312: 235-239.[5] EREXSON GL, PERIAGO MV, SPICER C S. Differential sensitivity of Chinese hamster V79 and Chinese hamster ovary (CHO) cells in the in vitro micronucleus screening assay[J]. Mutation Research, 2001, 495: 75-80.[6] EKE D, CELIK A. Genotoxicity of thimerosal in cultured human lymphocytes with and without metabolic activation sister chromatid exchange analysis proliferation index and mitotic index[J]. Toxicology in vitro, 2008, 22: 927-934.。
鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
五菌株鉴定和保存
四种标准试验菌株必须进行基因型鉴定、自发回变数鉴定及对鉴别性致突变物的反
应鉴定，合格后才能用于致突变试验。
1.菌株基因型鉴定
}I)组氨酸营养缺陷鉴定(组氨酸需求试验):
取两个底层培养基、其中一组于培养基表面涂加0. 1毫升0.
培养基成分或试剂除说明外，应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当
保存温度和期限。
2.培养基制备_
C1)营养肉汤培养基
牛肉膏2. 5g
胰陈(或混合蛋白膝)5. 0g
氯化钠2. 5g
磷酸氢二钾(KZHPO}.3H20 ) }. . 3 g
蒸馏水至500mL
加热溶解，调pH至7. 4，分装后0. 103MPa 20min灭菌，4℃保存备用。C2}?营养肉汤琼脂培养基:
迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37艺培养拐介时观察结果。
二，点试法
在攻层培养平皿上写上记号。取已融化并在45℃水浴中保温的顶层培养基一管(2m } )，加
人是试菌菌涛}_ }h-(_pmt }}}}(} }3}r,，、。"} } }}二_;、}1} .,e} \}
肝S9液1. 0 mL
混匀，置冰浴待用。菌株及增菌培养
试验菌株
四
采用四株鼠伤寒沙门氏突变型菌株TA97, TA98, TA100和TA102 o TA97, TA98可检侧
移码型诱变剂:TA100可检测碱基置换型诱变剂;TAZOZ检出移码型和碱基置换型诱变剂。
这4种标准菌株除均有组氨酸突变(his)外还有一些附加突变，可以提高试验菌株对致突
鼠伤寒沙门氏菌试验(Ames试验)文献综述
文献综述：鼠伤寒沙门氏菌试验（Ames试验）摘要：食品安全无论如何怎样强调都不会过分，迅速而准确地检测致癌物质是食品安全问题的重要方面。
美国科学家Dr. Bruce Ames及其同事创立了一种方法，叫鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验），它是利用一组组氨酸营养缺陷型菌株加入待测物在有或没有微粒体活化系统条件下，发生回复突变的特征鉴定化学物质的诱变活性，现已成为初步筛选化学物潜在致突变的首选方法。
关键词：鼠伤寒沙门氏菌试验；基本原理；一般步骤；应用及其研究进展；1 前言污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。
世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。
美国科学家Dr. Bruce Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。
该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。
众多学者有的用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性；有的用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性（比如，美国派斯净水器就通过了Ames 试验），探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施；或检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据；有的检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类；检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；用Ames 试验研究化合物结构与致变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据；检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患；还有用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等[1]。
2 定义2.1 回复突变（Reverse mutation）细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。
体外哺乳动物细胞微核试验及起草说明
推荐用姬姆萨染色（5％～10％姬姆萨染液，15min～20min），也可用DNA特异性荧光染料（如：吖啶 橙或Hoechst 33258）。
如果需要区分染色体断裂剂和非整倍体诱变剂，可用荧光原位杂交（FISH）或引物原位标记等方法。 6.4 阅片 6.4.1 微核的判断标准 微核一般为圆形或椭圆形；直径不超过主核的1/3；与主核在一个焦点平面上，与主核的颜色、结构特 征及折光性一致；与主核之间没有核物质相连，可以和主核有边界的重叠，但能看清各自的核膜。 6.4.2 方案一：使用cytoB 每个剂量组至少分析2000个双核细胞，计算微核细胞率（一个双核细胞不论含有几个微核，都只算作 一个含微核细胞）。如果单次培养可供计数的双核细胞数少于2000，则应采用多次细胞培养或平行培养， 以获得足够分析的细胞。对不规则的双核细胞（如两个核大小相差悬殊）和多于两个核的细胞不进行分析。 6.4.3 方案二：不使用cytoB 每个剂量组至少分析2000个细胞，计算微核细胞率。如果单次培养可供计数的细胞数少于2000，则应 采用多次细胞培养或平行培养。 6.5 统计处理： 数据按不同剂量列表，指标包括细胞毒性、观察细胞数、含微核细胞数及微核细胞率。受试物各剂量 组与阴性对照组（溶剂对照组）、阳性对照组的微核细胞率用适当的统计学方法（如χ２检验）进行处理。 6.6 结果判定： 在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中为阳性结果： 6.6.1 受试物引起微核细胞率的增加具有统计学意义，并与剂量相关； 6.6.2 受试物在任何一个剂量条件下，引起的微核细胞率增加具有统计学意义，并有可重复性。 7 结果解释
5.1 细胞株 可选用中国仓鼠肺细胞株（V79、CHL）或卵巢细胞株（CHO）、小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y）、人 外周血淋巴细胞株（如 TK6）或原代培养细胞。推荐使用CHL或L5178Y细胞株。细胞在使用前应进行染色 体数目稳定性和有无支原体污染的检查。 5.2 培养基
绞股蓝丹参三七提取物混合粉毒理学安全性评价
绞股蓝丹参三七提取物混合粉毒理学安全性评价【摘要】目的进行绞股蓝丹参三七提取物混合粉毒理学安全性评价。
方法采用限量法的雌、雄性大鼠急性经口毒性试验，遗传毒性试验（细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验），90天经口毒性试验，致畸试验。
结果在本试验条件下，绞股蓝丹参三七提取物混合粉雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50大于20.0g/kg.bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；绞股蓝丹参三七提取物混合粉以5g/kg.bw、10g/kg.bw、15g/kg.bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围内；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。
绞股蓝丹参三七提取物混合粉对大鼠未见母体毒性、胚胎毒性和致畸性。
结论绞股蓝丹参三七提取物混合粉长期食用是安全的。
【关键词】绞股蓝；丹参；三七；毒理学绞股蓝［Gynostemma Pentaphyllum（Thumb）Mak］又名“七叶胆”，是葫芦科绞股蓝属植物。
经临床及实验证明，绞股蓝具有抗疲劳，降低过氧化脂质，促进细胞新陈代谢以及临床治疗气虚、阳虚、白发及防治老年病、抗癌方面有积极作用[1]。
《中华人民共和国药典》则归纳丹参的功用为祛瘀止痛，活血通经，清心除烦”。
说明丹参具有多方面的功效。
在临床应用方面丹参制剂可用于治疗心血管系统疾病如冠心病、缺血性卒中等。
使我们对丹参的认识更加全面和深入[2]。
三七是中国的特有药用植物，三七可止血生肌、活血化瘀、消肿定痛、补血健体。
到近代三七应用广泛，已被列为“参茸桂七”并列名药之首。
同时数百成方中加入三七使皆得益彰，就是在名药“云南白药”中亦是重要的原料之一。
19.胃肠安丸的chl细胞染色体畸变试验
胃肠安丸的CHL细胞染色体畸变试验研究单位：军事医学科学院毒物药物研究所国家北京药物安全评价研究中心专题负责人：马华智（高级实验师）实验操作人员：孙艳丽（助理实验师）闫小娇（实验员）质量保证人员：廖明阳（研究员）盛和章（实验师）郭巧珍（实验师）王建京（助理实验师）摘要用中国仓鼠肺成纤维细胞（CHL）染色体畸变试验检测胃肠安丸的遗传毒性。
培养细胞计数法测定胃肠安丸对CHL细胞的毒性，毒性实验结果显示胃肠安丸在3.1–3200.0μg/ml浓度下，染毒4小时和32小时的细胞生长半数抑制浓度（IC50）大于3200μg/ml。
染色体畸变试验中胃肠安丸设三个受试浓度，为800.0、1600.0与3200.0μg/ml。
两种染毒条件：1）在S9活化和非活化系统条件下染毒4小时，在用新鲜培养基培养至32小时；2）在非活化系统条件下连续染毒32小时。
实验同时设溶剂对照组及阳性对照组。
每组镜下观察200个中期分裂相细胞，观察染色体结构畸变及裂隙细胞发生率，同时计数200个中期分裂相细胞中的数目畸变率。
结果表明，胃肠安丸在上述染毒条件下均不诱发CHL细胞染色体畸变率增高，畸变率均在5%以内，也不诱发染色体数目畸变及裂隙细胞数增加，与溶剂对照相比均无明显的改变。
研究目的胃肠安丸具有芳香化浊，理气止痛，健胃导滞的作用，用于消化不良引起的腹泻，肠炎，菌痢，脘腹胀满，腹痛，食积乳积。
本试验参照国家药品监督管理局关于新药临床前毒理学评价《遗传毒理学研究技术指导原则》的有关要求，用CHL细胞染色体畸变试验评价胃肠安丸的致突变性。
1.材料与方法1.1供试品和对照品：1.1.1供试品基本信息：名称：胃肠安丸批号：A109127供试品编号：-----纯度：每毫升含量相当于80毫克生药。
理化性质：棕红色水溶液。
供试品稳定性和保管（对温度、湿度、光线的要求及保存条件）：在密封、避光、室温条件下保存。
供试品配制方法：用水稀释成其它浓度的使用溶液。
化妆品安全技术规范
化妆品安全技术规范附件2细菌回复突变试验Bacterial Reverse Mutation Assay1 范围本规范确定了细菌回复突变试验的基本原则、要求和⽅法。
本规范适⽤于化妆品原料及其产品的基因突变检测。
2定义2.1 回复突变 reverse mutation细菌在化学致突变物作⽤下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。
2.2 基因突变 gene mutation在化学致突变物作⽤下细胞D NA 中碱基对的排列顺序发⽣变化。
2.3 碱基置换突变 base substitution mutation引起D NA 链上⼀个或⼏个碱基对的置换。
碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。
转换是D NA 链上的⼀个嘧啶被另⼀嘧啶所替代，或⼀个嘌呤被另⼀嘌呤所代替。
颠换是D NA 链上的⼀个嘧啶被另⼀嘌呤所替代，或⼀个嘌呤被另⼀嘧啶所代替。
2.4 移码突变 frameshift mutation引起D NA 链上增加或缺失⼀个或多个碱基对。
2.5 细菌回复突变试验Bacterial reverse mutation assay利⽤⼀组组氨酸或者⾊氨酸缺陷型试验菌株测定引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的氨基酸缺陷型→原养型回复突变的试验⽅法。
2.6 S9经多氯联苯(PCB混合物)或苯巴⽐妥钠和β-萘黄酮结合诱导的⼤⿏制备肝匀浆，在9000g 下离⼼10min 后的肝匀浆上清液。
3 原理⿏伤寒沙门⽒组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数⾃发回复突变的细菌⽣长；⼤肠杆菌⾊氨酸营养缺陷型菌株不能合成⾊氨酸，故在缺乏⾊氨酸的培养基上，仅少数⾃发回复突变的细菌⽣长。
假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因⽽能⽣长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。
某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加⼊经诱导剂诱导的⼤⿏肝制备的S9混合液。
体外哺乳动物细胞TK基因突变试验原理及注意事项
体外哺乳动物细胞TK基因突变试验原理及注意事项TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。
TK基因突变属于常染色体基因突变。
TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反应。
在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。
但如在细胞培养物中加入胸苷类似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT)，则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，进而掺入DNA，造成致死性突变,故细胞不能存活。
若TK基因发生突变，导致胸苷激酶缺陷,则TFT不能磷酸化，亦不能掺DNA，故突变细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。
根据突变集落形成数可计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。
在TK基因突变试验结果观察中可发现两类明显不同集落，即大/小集落(L5178Y细胞)或正常生长/缓慢生长集落(TK6细胞)，有研究表明，大集落/正常生长集落主要由点突变或较小范围的缺失等引起，而小集落/缓慢生长集落主要由较大范围的染色体畸变，或由涉及调控细胞增殖的基因缺失引起。
北京汇智泰康医药技术有限公司针对小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验开发染TK基因突变试剂盒，本试剂盒针对小鼠淋巴瘤细胞L5178Y开展TK基因突变试验，试剂盒省去了阳性底物成分、筛选培养基准备、诱导 S9 制备，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，诱导 S9 活性均符合小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。
染色体畸变试验试剂盒应用广泛，可进行食品、化学品、农药、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒理学检测。
TK基因突变试验导则1 范围本标准规定了体外哺乳类胸苷激旃(thymidine kinase TK)基因突变试验的基本试验方法与技术要求。
实验五.大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定1 实验目的学会大鼠肝S9的制备及其蛋白含量的测定。
2 实验材料与方法2.1实验动物大鼠：健康、雄性、成年，SD或Wistar ，5~6 周龄，150g左右2.2试剂1.17% （0.15M） KCl、苯巴比妥钠、戊巴比妥钠、多氯联苯、β-萘黄酮Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约800ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml2.3器材低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等2.4 实验操作2.4.1试剂的配制（1）Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml（2）考马斯亮兰G-250染料：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸馏水稀释至1升，滤纸过滤。
2.4.2肝S9的制备（1）诱导苯巴比妥钠80mg/kg，腹腔注射，连续3～5d，最后一次给药后24h后采样。
（2）采样采样前禁食24h，但可以自由饮水；断头处死；无菌取出肝脏，置平皿中称重，用预冷的0.15M KCl溶液淋洗数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。
（3）肝匀浆的制备弃去淋洗液，将肝脏转入小烧杯，加 Tris-HCl缓冲液溶液3mL/g （肝湿重），转入冰浴，用剪刀剪碎肝脏，转入匀浆器匀浆。
（4）制备S9 将肝匀浆于低温高速离心机0～4℃ 000g 离心 10min上清液即为S9。
（5）分装保存将制备好的S9于无菌冷冻管或安瓿中保存，每个安瓿2mL左右。
于液氮速冻后置-80℃低温保存。
深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。
2.5蛋白含量测定（考马斯亮兰染色法）2.5.1测定原理考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质（主要是碱性氨基酸，特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基）结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm 变为595nm ，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。
联合诱导法制备大鼠肝S9及蛋白含量的测定
联合诱导法制备大鼠肝S9及蛋白含量的测定摘要】目的测定联合诱导法和多氯联苯诱导法制备的大鼠肝S9的蛋白含量并对这两种方法进行比较。
方法采用苯巴比妥与β—萘黄酮合并诱导所获S9作为诱导剂制备大鼠肝S9,并采用Bradford法测定所制备的S9蛋白含量。
结果成功制得大鼠肝S9,并测定其蛋白含量为26.73 mg/ml。
结论联合诱导法可以替代多氯联苯诱导法制备肝匀浆S9。
【关键词】联合诱导法 S9制备蛋白含量测定Preparation of rat liver S9 by combination inducing method and determination of protein in the prepared S9Yu Dawei, Houyandong*,(Gansu Provincial Center for Disease Control ＆ Prevention, Lanzhou 730000)【ABSTRACT】 Objective: To determine the content of protein in rat liver S9 prepared by combination inducing method and PCB inducing method and compare the two methods. Methods: Rat liver S9 was prepared using S9 obtained by combination inducing method with phenobarbital and β-naphthoflavone as the inducer and the content of protein in the prepared S9 was determined by Bradford method. Results: Rat liver S9 was successfully prepared and the protein content was 26.73 mg/ml. Conclusion: Combination inducing method may supersede PCB inducing method for preparation of liver homogenate S9.【Key words】 combination inducing method S9 preparation protein determination 多氯联苯(Polychlorinated biphenyls , PCBs)是一种极其稳定的致癌剂，目前环境中所存在的10亿多磅多氯联苯已引起人们的关注。
7实验七 大鼠肝S9的制备
肝匀浆制备
–
弃去淋洗液，将肝脏转入小烧杯，加 0.15M KCl溶液 3mL/g （肝湿重），转入冰浴 用剪刀剪碎肝脏，转入匀浆器
–
–
–
玻璃匀浆器
或组织匀浆器
低于4000r/min，1～2min
20000r/min，1min
※ 以上操作需注意无菌和局部冷环境
S9制备
离心
肝匀浆 高速离心机
0～4℃
实验六 大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定
器材和试剂
器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注 射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等 试剂： 1.17% （0.15M） KCl Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解， 用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至 1000ml
溶剂
剂量
玉米油 3d
浓度
200mg/mL
腹腔注射
500mg/kg 方式
时间
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
采样 第4d
同时诱导P450和P448 4.β-萘黄酮 玉米油， 80mg/kg，腹腔注射连续 3d，第4d采样。主要诱导P448
采样
采样前禁食24h，但可以自由饮水； 断头处死，用75%酒精消毒动物皮部，剖开 腹部； 无菌取出肝脏，置平皿中称重，用预冷的 0.15M KCl溶液淋洗数次，以便除去能抑 制微粒体酶活性的血红蛋白。
操作步骤
实验动物
大鼠：健康 雄性 成年 SD 或 Wistar 5~6 周 龄 150g左右
诱导
1. 苯巴比妥钠 80mg/kg， 腹腔注射，连
续3～5d，最后一次给药后24h后采样。 主要诱导P450 2. 戊巴比妥钠 80mg/kg，腹腔注射，连
两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒性试验中活性比较
两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒性试验中活性比较王亚其;李宏霞;肖凯;刘玉清;刘斌;兰明【期刊名称】《现代预防医学》【年(卷),期】2006(33)4【摘要】目的:通过比较联合诱导法和多氯联苯诱导法制备的S9的活化作用,探讨两种S9活化作用的差异对两种试验阳性结果的影响。
方法:采用Ames试验方法和染色体畸变试验方法对两种S9活化的阳性结果进行比较。
Lowry法测定两种S9的蛋白含量,Omura法测定P450含量。
结果:Ames试验和染色体畸变试验中两种S9在阳性组中都显示出明显活化作用,同一条件下,Ames试验中使用两种S9所得阳性结果并无较大差异,染色体畸变试验中两种S9活化的阳性组畸变率间差异无统计学意义(P>0·05)。
多氯联苯诱导法S9的蛋白含量13·25g·L-1,P450含量为3·92nmol·mg-1蛋白,联合诱导法S9蛋白含量为15·25g·L-1,蛋白含量P450含量为2·94nmol·mg-1蛋白。
结论:两种S9在Ames试验和染色体畸变试验中对相应阳性诱变剂都有明显的活化作用。
可以认为两种S9在Ames试验和染色体畸变试验中对于相应的阳性化学物活化作用无较大差异,联合诱导法可以替代多氯联苯诱导法制备肝匀浆S9。
【总页数】4页(P457-459)【关键词】联合诱导法;多氯联苯诱导法;肝S9;Ames试验;染色体畸变试验;Lowry 法;Omura法【作者】王亚其;李宏霞;肖凯;刘玉清;刘斌;兰明【作者单位】四川大学华西医学中心公共卫生学院;国家成都中药安全性评价中心【正文语种】中文【中图分类】R99【相关文献】1.不同诱导方法制备大鼠肝微粒体酶及其活性的比较 [J], 高梅;曹冲;英永;马会;贾庆文2.联合诱导法制备大鼠肝S9及蛋白含量的测定 [J], 余大为;侯言东(通讯作者)3.螺旋涂布法评价联合诱导制备大鼠肝 S9的活性大小 [J], 单纯;张凤兰;崔生辉4.自拟通络祛浊方对两种不同方法诱导大鼠非酒精性单纯性脂肪肝模型的干预效果及机制研究 [J], 金毅;吕爱贞;黄宝明;邢伟;郑又铭;张金龙;杨雯;徐愉林;李静5.在鼠伤寒沙门氏菌致突变试验中比较人肝细胞和人肝S9与大鼠肝制剂活化系统对激活诱变剂的影响 [J], 王国钦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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操作步骤
实验动物
大鼠：健康 雄性 成年 SD 或 Wistar 5~6 周 龄 150g左右
诱导
1. 苯巴比妥钠 80mg/kg， 腹腔注射，连
续3～5d，最后一次给药后24h后采样。 主要诱导P450 2. 戊巴比妥钠 80mg/kg，腹腔注射，连
续3d，第4d采样。主要诱导P450
3.多氯联苯（Aro-clor1254或国产PCB-五氯）
溶剂
剂量
玉米油 3d
浓度
200mg/mL
腹腔注射
500mg/kg 方式
时间
采样 第4d
பைடு நூலகம்
同时诱导P450和P448 4.β-萘黄酮 玉米油， 80mg/kg，腹腔注射连续 3d，第4d采样。主要诱导P448
采样
采样前禁食24h，但可以自由饮水； 断头处死，用75%酒精消毒动物皮部，剖开 腹部； 无菌取出肝脏，置平皿中称重，用预冷的 0.15M KCl溶液淋洗数次，以便除去能抑 制微粒体酶活性的血红蛋白。
肝匀浆制备
–
弃去淋洗液，将肝脏转入小烧杯，加 0.15M KCl溶液 3mL/g （肝湿重），转入冰浴 用剪刀剪碎肝脏，转入匀浆器
–
–
–
玻璃匀浆器
或组织匀浆器
低于4000r/min，1～2min
20000r/min，1min
※ 以上操作需注意无菌和局部冷环境
S9制备
离心
肝匀浆 高速离心机
0～4℃
实验六 大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定
器材和试剂
器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注 射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等 试剂： 1.17% （0.15M） KCl Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解， 用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至 1000ml
低温
速度
9000g 离心 10min
※g=1.11×10(-6)R平均×（rpm)2
g
相对离心力
转头的平均直径，以mm计算
R平均
–
rpm 每分钟转数 上清液即为S9组分
分装
于无菌冷冻管或安瓿中，安瓿 2mL左右。
保存
液氮速冻后置-80℃低温保存。
检查 – 无菌检查 – 蛋白含量测定(Bradford法)，每毫升蛋白含量 应不超过40mg为宜，因过量蛋白将会抑制回 复突变率 – 生物活性合格 贮存 – 深低温或冰冻干燥 – 保存期不超过一年