7实验七 大鼠肝S9的制备
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实验六 大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定
器材和试剂
器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注 射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等 试剂： 1.17% （0.15M） KCl Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解， 用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至 1000ml
肝匀浆制备
–
弃去淋洗液，将肝脏转入小烧杯，加 0.15M KCl溶液 3mL/g （肝湿重），转入冰浴 用剪刀剪碎肝脏，转入匀浆器
–
–
–
玻璃匀浆器
或组织匀浆器
低于4000r/min，1～2min
20000r/min，1min
※ 以上操作需注意无菌和局部冷环境
S9制备
离心
肝匀浆 高速离心机
0～4℃
操作步骤
实验动物
大鼠：健康 雄性 成年 SD 或 Wistar 5~6 周 龄 150g左右
诱导
1. 苯巴比妥钠 80mg/kg， 腹腔注射，连
续3～5d，最后一次给药后24h后采样。 主要诱导P450 2. 戊巴比妥钠 80mg/kg，腹腔注射，连
续3d，第4d采样。主要诱导P450
3.多氯联苯（Aro-clor1254或国产PCB-五氯）
溶剂
剂量
玉米油 3d
浓度
200mg/mL
腹腔注射
500mg/kg 方式
时间
采样 第4d
同时诱导P450和P448 4.β-萘黄酮 玉米油， 80mg/kg，腹腔注射连续 3d，第4d采样。主要诱导P448
采样
采样前禁食24h，但可以自由饮水； 断头处死，用75%酒精消毒动物皮部，剖开 腹部； 无菌取出肝脏，置平皿中称重，用预冷的 0.15M KCl溶液淋洗数次，以便除去能抑 制微粒体酶活性的血红蛋白。
低温
Baidu Nhomakorabea
速度
9000g 离心 10min
※g=1.11×10(-6)R平均×（rpm)2
g
相对离心力
转头的平均直径，以mm计算
R平均
–
rpm 每分钟转数 上清液即为S9组分
分装
于无菌冷冻管或安瓿中，安瓿 2mL左右。
保存
液氮速冻后置-80℃低温保存。
检查 – 无菌检查 – 蛋白含量测定(Bradford法)，每毫升蛋白含量 应不超过40mg为宜，因过量蛋白将会抑制回 复突变率 – 生物活性合格 贮存 – 深低温或冰冻干燥 – 保存期不超过一年
器材和试剂
器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注 射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等 试剂： 1.17% （0.15M） KCl Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解， 用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至 1000ml
肝匀浆制备
–
弃去淋洗液，将肝脏转入小烧杯，加 0.15M KCl溶液 3mL/g （肝湿重），转入冰浴 用剪刀剪碎肝脏，转入匀浆器
–
–
–
玻璃匀浆器
或组织匀浆器
低于4000r/min，1～2min
20000r/min，1min
※ 以上操作需注意无菌和局部冷环境
S9制备
离心
肝匀浆 高速离心机
0～4℃
操作步骤
实验动物
大鼠：健康 雄性 成年 SD 或 Wistar 5~6 周 龄 150g左右
诱导
1. 苯巴比妥钠 80mg/kg， 腹腔注射，连
续3～5d，最后一次给药后24h后采样。 主要诱导P450 2. 戊巴比妥钠 80mg/kg，腹腔注射，连
续3d，第4d采样。主要诱导P450
3.多氯联苯（Aro-clor1254或国产PCB-五氯）
溶剂
剂量
玉米油 3d
浓度
200mg/mL
腹腔注射
500mg/kg 方式
时间
采样 第4d
同时诱导P450和P448 4.β-萘黄酮 玉米油， 80mg/kg，腹腔注射连续 3d，第4d采样。主要诱导P448
采样
采样前禁食24h，但可以自由饮水； 断头处死，用75%酒精消毒动物皮部，剖开 腹部； 无菌取出肝脏，置平皿中称重，用预冷的 0.15M KCl溶液淋洗数次，以便除去能抑 制微粒体酶活性的血红蛋白。
低温
Baidu Nhomakorabea
速度
9000g 离心 10min
※g=1.11×10(-6)R平均×（rpm)2
g
相对离心力
转头的平均直径，以mm计算
R平均
–
rpm 每分钟转数 上清液即为S9组分
分装
于无菌冷冻管或安瓿中，安瓿 2mL左右。
保存
液氮速冻后置-80℃低温保存。
检查 – 无菌检查 – 蛋白含量测定(Bradford法)，每毫升蛋白含量 应不超过40mg为宜，因过量蛋白将会抑制回 复突变率 – 生物活性合格 贮存 – 深低温或冰冻干燥 – 保存期不超过一年