胶内酶解质谱样品前处理

胶内酶解质谱样品前处理-蛋白考染胶

溶液配制：

1、水：HPLC级；乙腈：HPLC级；乙醇：HPLC级；

2、200mM NH4HCO3溶液：取NH4HCO3 790.6mg 加水溶解并稀释到50ml。稀释4倍得到50 mM

NH4HCO3溶液，稀释8倍得到25 mM NH4HCO3溶液；

3、25mM NH4HCO3的50%的乙醇-水溶液（考染脱色液）： 50%乙醇-水溶液和50mM NH4HCO3

溶液等比例混匀；

4、10%乙酸的50%乙醇-水溶液；

5、DTT溶液：10mM DTT的25mM NH4HCO3溶液（1.54mg/ml，现配此浓度，-20℃保存须两天内用完）；

6、IAA溶液： 55mM IAA的25mM NH4HCO3溶液（10.175 mg/ml，现配此浓度，避光保存，-20℃

保存须两天内用完）；

7、Trypsin 溶液：取储存于-80℃的分装浓缩酶溶液（浓度为100ng/ul（20ug到200ul），

溶于50 mM NH4HCO3溶液中）,用50 mM NH4HCO3溶液稀释为10ng/ul，全程冰上操作；

8、50％乙腈-水溶液（含5%三氟乙酸）；

9、75%乙腈-水溶液（含0.1%三氟乙酸）；

10、0.1%三氟乙酸-水溶液；

11、50%乙腈-水溶液（含0.1%三氟乙酸）。

12、避光新鲜配置脱色液(银染)：50 mM NaS2O3: 15 mM K3Fe(CN) = 1：1混合

取胶

1.用超纯水清洗胶块2次，用手术刀片切下胶上目标条带，用手术刀片充分切碎(1mm3大小，

用HPLC级异丙醇和水分别洗涤手术刀和镊子)。

第一天：

考马斯亮蓝染色凝胶的脱色

2.把切碎的胶块置于1.5ml管中（预先加入1ml考染脱色液，含25mM NH4HCO3的50%的乙醇-

水溶液），室温震荡15-20min（在混匀仪中高速震荡混匀），重复2-3次，直至胶块无色，14000rpm离心1min, 去上清。

3.加入1ml 10%乙酸的50%乙醇-水溶液在恒温混匀仪上室温震荡洗涤胶块2次，每次30分钟，

去上清。

4.加入1ml水，在恒温混匀仪上室温轻微震荡洗涤胶块胶块2次，每次5-10分钟，去上清。

5.加乙腈1ml漩涡混合洗5min，弃液，真空抽干10min（1308室Christ冻干仪，使用浓缩功

能，下同）。

Destain银染凝胶的脱色

1.加 500μl脱色液，室温避光震荡5～10 min，14000rpm离心1min，弃去溶液，重复 1～2 次至胶块去除银染颜色。

2.加 500 μl 50mM NH4HCO3，震荡 5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液，重复 1～2次至溶液无明显黄色。再加 500 μl 50%乙腈，震荡 5～10 min，14000rpm离心1min，弃去溶液。

3.加 500μl 50mM NH4HCO3，震荡 5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液。再加1ml 50%乙腈，震荡 5～10 min，14000rpm离心1min，弃去溶液，至胶块呈白色。

5. 加乙腈1ml漩涡混合洗5min，弃液，真空抽干10min（1308室Christ冻干仪，使用浓缩功能，下同）。

还原烷基化

5. 加入 30-60ul (可适当多加，没过胶条) DTT溶液，56℃恒温混匀仪上震荡孵化1小时，

冷却至室温，离心去上清，真空抽干10min。

6. 加入 30-60ul IAA溶液(体积与DTT大体相同)，暗处室温孵育45min，去上清。

7.加1ml 50 mM NH4HCO3溶液震荡洗胶块10min，14000rpm离心1min,去上清。

8.加1ml水震荡洗胶块10min，14000rpm离心1min,去上清。

9.加乙腈1ml漩涡混合洗5min，14000rpm离心1min, 去上清，真空抽干10min。

酶解

10.把胶粒转移至0.6ml的离心管中，加入25～35ul Trypsin 溶液（酶与底物蛋白的质量比

约为1:20～1:50），冰上放置10min，中间检查确保胶块完全浸泡在酶液中，如果没有充分吸胀，补加一定量的酶液（酶液体积根据胶块大小确定，稍多于胶水溶液状态体积）待溶液被胶块完全吸收，加10～20ul 50mM NH4HCO3， 37℃酶解16-20小时。

第二天：

肽段提取

10.吸出酶解液至新的0.6ml离心管中，加2-3倍于胶体积的50％乙腈-水溶液（含5%三氟乙酸）至原管中（视胶条大小而定），恒温混匀仪室温震荡15min（不可漩涡离心混合），离心1min，吸取上清转移至同一0.6ml离心管中，盖管标记。

11.加2-3倍于胶体积的75%乙腈-水溶液（含0.1%三氟乙酸）中，恒温混匀仪室温震荡10min

（不可漩涡离心混合），离心1min，吸取上清合并至上管中。

12. 加2-3倍于胶体积的乙腈中，恒温混匀仪室温震荡5min（不可漩涡离心混合），离心1min，吸取上清合并至上管中。

13.合并3次提取液，真空干燥，-20℃保存。保存胶条，备用（防止酶解不充分）。

14.样品制备完成，溶解样品在10ul 0.1%三氟乙酸-水中。

微量蛋白及肽段溶液的 Ziptip脱盐

1. 准备：

(1)、平衡管1：乙腈（1ml/支，1.5ml离心管）；

(2)、平衡管2：50%乙腈-水（含0.1%三氟乙酸）（1ml/支，1.5ml离心管）；

(3)、平衡管3： 0.1%三氟乙酸-水（1ml/支，1.5ml离心管）；

(4)、脱盐管：0.1%三氟乙酸-水（1ml/支，1.5ml离心管）；

(5)、洗脱液管： 50%乙腈-水（含0.1%三氟乙酸）（10ul/支，0.6ml离心管，如样品

含疏水性肽段较多，可以增加乙腈至75%）

2. 具体操作如下：

（1）平衡：乙腈冲洗 ziptip 1次（吸取-废弃至管外低尘纸上），50%乙腈-水冲洗 ziptip 1次（吸取-废弃至管外低尘纸上），0.1%三氟乙酸-H2O冲洗 ziptip 5次（吸

取-废弃至管外低尘纸上）；

（2）吸附样品：加10uL 0.1%三氟乙酸-水充分溶解，低速离心，ziptip反复吸打样品15-20次；

（3）冲洗：0.1%三氟乙酸-水冲洗 ziptip 3次（吸取-废弃至管外低尘纸上）；

（4）洗脱：用 10uL 洗脱液反复吸打 ziptip 15-20次。

(5) 复溶：真空抽干，在洗脱液管中加入 0.1%甲酸-水6ul，在旋涡混合仪上充分溶解，

待质谱分析。

蛋白质前处理注意事项

注：上述过程需要：

1、洁净的环境，实验服、口罩、帽子、无粉丁腈或乙烯基手套（严禁使用乳胶手套）操作，

实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净，防止角蛋白污染，并带口罩和帽子；

尽量避免蛋白质点和相关溶液与外界空气接触, 避免可能造成的污染。

2、对于鉴定修饰样品，蛋白纯度和丰度越高越好，需要尽可能的提高蛋白纯度和丰度。

3、胶条保存在离心管中，加入相当于胶条高度1/3的水，在胶条处理之前保持湿润状态，

防止胶条变干，胶条保存放在4℃。

4、所有离心管、枪头均为进口产品；所有试剂均为进口分析纯，实验用水均为进口HPLC级；

5、每加一次溶液都要漩涡振荡，胶粒要完全浸没在溶液中，进行下一步操作前要把溶液吸

走。

6、加酶之前，可不用换移液枪头；但在加酶之后，必须每管换枪头，因为酶将蛋白释放出

来；

7、Ziptip u-C18多肽吸附量 1-2ug(鉴定修饰), Ziptip C18多肽吸附量 1-5ug（其他）。

8、尽可能在最短的时间内完成脱盐前的步骤，不建议中间步骤停顿过夜，含盐蛋白干粉相

对稳定，脱完盐后须尽快进行质谱分析。