01-治疗性抗体研发的进展和关键技术

Pool Bulks
Formulation
Drug Product
Cap Vials
Product Inspection
Container Integrity Testing
李锋
Labeled Final Vial Product
Packaging
从细胞表达到病人临床注射，单抗体药物可能发生多种反应变化
突变Gly236Ala，Ser239Asp，ILe332Glu提高 ADCP和ADCC
杂合IgG亚型提高CDC 突变Met252Tyr，Ser254Thr，Thr256Glu增加
抗体的半寿期
2 改变抗体Fc的糖基化
各种糖基化变化对抗体功能的影响
来自潘海报告
第三代抗体药物
抗CD20 obinutuzumab（糖基化改造，提高 ADCC）
引自张伯彦报告
影响抗体药物稳定性和效能的因素
可变区： 选择Gln为氨基末端，减少电荷变异 突变CDR区上不稳定的点 突变某些氨基酸，避免抗体聚合 去除可变区上的糖基化位点
恒定区： 铰链区改造避免出现半个抗体和不规则 二硫键或异型结构 提高与FcRn结合，增加血清半寿期
单抗体药物产品是各种变异体的混合物
治疗性抗体研发的进展和关键技术
沈倍奋 军事医学科学院基础医学研究所
主要内容
治疗性抗体研发概况 治疗性抗体研发的主要进展 治疗性抗体研发中要注意的问题
用Fra Baidu bibliotek体药物治疗的疾病
肿瘤 自身免疫病 感染性疾病 抗移植排斥 心血管疾病
骨质疏松 罕见病 眼黄斑变性 炭疽
抗体结构与功能关系
FDA批准的ADC药物
放射性同位素，Bexxar, Zevalin 毒素 小分子药物，Mylotarg，T-DM1
Adcetris
4 双特异性抗体
欧洲上市的双特异性抗体
在临床试验的双特异性抗体
抗体名称
SAR156597 AFM13 FBT-A05,Bi20 MT110 MT111,MEDI565 IMCgp100 TF2 MEHD-7945A MM-111 CVX-241 Ozoralizumab ATN103
抗体药物的作用机理
直接效应 间接效应
诱导凋亡 抑制增殖 阻断生长因子或生长因子受体 干扰血管生成 依赖补体的细胞毒（CDC） 依赖抗体的细胞毒（ADCC) 作为毒素、放射性同位素和细胞
毒药物的载体 形成抗独特型抗体 通过双特异性抗体靶向效应细胞
抗体药物在临床应用中面临的挑战
免疫原性 杀伤靶细胞的活性弱 成药性问题 新靶点
Oxidation (M, W, H, F, Y)
1。影响抗体质量的蛋白表达后修饰细胞内细胞外都有发生； 2。质控的目标是降低或避免在生产过程中不希望看到的 PTM和序列变异发生的
mAb Variants and Characterization Methodologies
1. Size Variants (体积变异体） – Terminologies: Aggregates, main peak, fragments – Assays: HPSEC, CE-SDS, SDS-PAGE, AUC
候选基因 可成药的候选药靶
与疾病的相关性
治疗性抗体研发中要注意的问题
抗体分子L结构特点：四条肽链，重链糖基 化，结构上有较多二硫键
抗体结构与成药性的关系
Protein expression Solubility stability
单抗体生产工艺和过程
Working Cell Bank
Master Cell Bank Raw Materials
克隆筛选是质量控制的关键步骤
S-Cysteinylation Disulfide scrambling S-Glutathionylation Thioether formation Reduction
Deamidation (NG,NT,NS) Isomerization (DG,DS,DD)
Transamination
SKVO3 –Her2+++
SKVO3 –Her2+++
HF人源抗体对Her2+ +细胞 的ADCC杀伤效应分析
SDS-PAGE非还原电泳
MCF7 - Her 2+
MCF7 - Her2
+
155KDa
HF
Herceptin
1986 1994 1997 1998 2000 2001 2002 2003 2004 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012
Basic Variants, 18%
7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4
50 40 30 20 10
0 40
序列变异体 by Tryptic Peptide Map Clone#
11
104
M83R
6
N1
3
45
50
55
Time / min
靶抗原
IL4 x IL13 CD30 x CD16A CD20 x CD3 EpCAM x CD3 CEA x CD3 Gp100 x CD3 CEA x IMP288 hapten EGFR x HER3;dual IgG1 HER2 x HER3 Ang2 x VEGF;dual IgG1 TNF x albumin
ADCETRIS (aCD33-vcMMAE) Seattle Genetics
Thio-Mab or Ambrx’s unnatural AA incoporation
单抗: 癌细胞表面过量表达的抗原且能内吞。 偶联链: 在血液中稳定但可以在细胞内释放毒素。
毒素药物: 需要极毒的可以抑制细胞生长的化合物
靶分子
CD20 HER2 CD52 EGFR VEGF CD33 CTLA-4 CD30
适应症
NHL CLL 乳腺癌 CLL 结肠癌 结肠癌 肺癌 AML 黑色素瘤 淋巴瘤
发现药物靶标的主要方法
分子流行病学调查 人类遗传学研究 人类功能基因组学 蛋白组学 生物信息学 药理学 模式动物
美国FDA： Steven Kozlowski 基因特克： Wassim Nashabeh
Absorbance at 214 nm
体积变异体 by SEC
二聚体
Upper pI Marker
Lower pI Marker
iCIEF
Main Peak, 54% 电荷变异体 by
Acidic Variants, 28%
抗CD20 ofatumumab （Arzerra， 全人抗体） 抗RSV motarizumab （亲和力更高）
） 抗EGFR panitumumab （Vectibix， 全人抗体
抗体效应功能的改造
定点突变改造Fc 改变糖基化 双特异性或多特异性抗体
减弱抗体的效应功能
Fc上进行定点突变 Teplizumab(Leu234Ala,Leu235Ala)
Amidation (C-term)* Di-, tri-sulfide bond formation
N, O-Glycosylation C-mannosylation (W) Proteolytic processing (C-term)
Sequence Variants
Glycation (K) Hydrolysis (DP)
去糖基化 Otelixizumab(去糖基化，Asn297Ala)
选择IgG4亚型或杂合亚型（IgG2/IgG4） Fc融合蛋白
提高抗体的效应功能
偶联细胞毒物质
抗体融合蛋白
双特异性抗体
改变抗体 效应功能
细胞内抗体
抗体Fc突变
改变抗体糖基化
1 抗体Fc突变提高效应功能
突变Ser239Asp，Glu330Leu，ILe332Glu提高 ADCC
2. Charge Variants （电荷变异体） – Terminologies: Acidic peak, main peak, and basic peak variants – Assays: HPIEC, iCIEF, pH-IEC
3. Sequence Variants （序列变异体）: caused by unintended amino acid substitutions – Terminologies: sequence polymorphism; mutation; mis-incorporation; sequence extension, insertion, deletion, and crossover. – Assays: Multiple proteolysis peptide mapping methods with LC-UV-MS/MS data analysis
EB病毒转化人B细胞 人-人杂交瘤技术 抗体库技术 转基因小鼠 人工设计和合成人源抗体
抗体库技术 转基因小鼠
人工设计和合成人源抗体
D4
抗原抗体复合物结构信息分析
Her2晶体结构
抗体专家分析系统
人源化抗体设计、虚拟筛选
HF人源抗体基因合成、构建、表达
HF人源表达抗体的纯化和功能鉴定
HF人源抗体对Her2靶点的特异性识别
pyro-E O D
D O G
D
O pyro-E D
D O G
D
G
G
KK • 脱氨基化 (3×2) • Met 氧化 (2×2) • 糖基化（2×2) • 高甘露糖化,G0, G1,G1’,G2（5） • 唾液酸化（5） • C-端Lys （2） • 2×6×4×4×5×5×2=9600 • (9600)2 ≈ 108 约1亿个可能的变异体！
AME-133v (Fc改造，提高ADCC) TRLI-05 (Fc改造，提高ADCC) Pro13192 (Fc改造，提高ADCC)
抗RSV/F MEDI-557 (Fc改造，增加半寿期)
3 抗体上偶联细胞毒物质
抗体-药物偶联技术
赖氨酸 偶联
轻重链间二硫键偶联
定点偶联
KADCYLA (T-DM1) Genentech/Immunogen
临床试验
Phase I Phase I Phase I Phase I Phase I Phase I Phase I Phase I Phase I Phase II Phase II
5 免疫细胞因子
靶抗原选择
针对已确认过的靶 临床确认 实验确认
寻找新的功能性靶抗原
自身免疫病的治疗靶
上市抗肿瘤抗体药物的靶抗原
OKT3 ReoPro Rituxan Simulect Mylotarg Campath Zevalin Xolair Avastin Lucentis Soliris Cimzia Stelara Actemra Benlysta Perjeta
Zenapax Synagis
Humira Bexxar Erbitux Vectibix
抗体药物研发的主要进展
降低抗体的免疫原性 改变抗体的效应功能 提高抗体表达量 引入先进的抗体表征和质控方法 改进抗体规模化生产技术 新靶点的发现
抗体人源化和人源抗体
CDR移植 FR移植 SDR移植 表面氨基酸重塑
Phage display 转基因鼠
单细胞PCR 人工设计
人源抗体制备的主要技术
细胞培养
酶糖基化 化学糖基化 还原反应 序列变异 ……
分离纯化
还原反应 水解反应 聚合化……
配伍制剂 和储藏
氧化反应 异构化 化学糖基化 ……
临床注射和 新陈代谢
脱氨基化 巯基半胱胺酸化 酶降解反应 ……
理化分析和质量控制对于抗体制药工业各个环节起着支持和指导的重要作用。 如同眼睛对人的作用一样，没有好的分析手段和方法，抗体生产过程就可能走向歧途。
Small-scale Cell Culture
Product Recovery Large-scale Cell Culture
Drug Substance
Product Filtration
Lyophilize Liquid Products
Sterile Filter, Fill, and Partial Stopper Vials
Simponi Numax Yervoy
鼠源
FDA批准的抗体药物
Remicade Herceptin Enbrel
Raptiva Tysabri
Ilaris Prolia
Arzerra ABThrax
嵌合
人源化
人源
第二代抗体药物
抗TNF adalimuab (Humira，全人抗体） certolizumab（Cimzia，PEG修饰的Fab） golimumab （Simponi，全人抗体）