产前诊断实验室技术
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22
正常男性染色体核型
正常女性染色体核型 23
21-三体男性染色体核型
21-三体女性染色体核型 24
羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测
原理： 经过荧光素标记的DNA探针，可特异性的与染色体 上与之互补的序列相结合，从而使染色体对应位置 上发出荧光信号
培养5~7天 一般7天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，
当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细 胞时，视情况（有较好的梭形细胞克隆）可换上完全 培养基，继续培养24-48小时 如细胞生长状况好，即可加入秋水仙素作用4-6小时左 右行细胞学处理。
21
细胞收获及染色体制备实验步骤
倒出倒出瓶中细胞上清液入15ml离心管中 0.25% EDTA-trypsin消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改
无明显增加 无明显增加 无明显增加
12
产前诊断取材
绒毛膜穿刺术 羊膜腔穿刺 脐静脉穿刺术
13
绒毛膜穿刺术
在妊娠9-11周之间进行 一次绒毛活检获取20mg左右的绒毛组织可满足
任何产前诊断的需要 操作相关的流产率约为1%
14
羊膜腔穿刺术
孕18-24周 B超引导下 取羊水25-30ml
基因组病：SNP-array, array-CGH
单基因遗传病:PCR，基பைடு நூலகம்测序等 多基因遗传病：疾病易感基因研究
6
染色体异常的发生机率
活产婴儿
先天性智力障碍（MR）患者 先天性心脏病
0.6%
23% 13%
死胎和围产期死亡胎儿
6.0%
自然流产(前三个月)
60%
7
染色体异常的发生机率
21-三体综合征新生儿发病率高达1/800 18-三体发病率约为1/8000 13-三体发病率约为1/20000 其它各种性染色体异常发病率约为1/1000
产前诊断实验室技术
1
主要内容
一、产前诊断基本知识介绍 二、产前诊断的取材 三、产前诊断主要实验室技术
羊水细胞染体核型分析 羊水细胞荧光原位杂交
2
为什么要进行产前诊断
围生儿期常见疾病的发生率大大降低 遗传性疾病的发生率逐年提高 遗传病不能根治，不少遗传病病情严重，甚 至导致患儿死亡或终生残疾 产前诊断可及时诊断遗传性疾病，有利于积 极采取预防措施，减少遗传病患儿的出生， 降低遗传性疾病的发生率
18
羊水细胞培养实验原理
标本采集：一般为孕18～24 周，此时羊水中所含成纤 维细胞和上皮样细胞多，较易生长
羊水细胞是胎儿皮肤等的脱落细胞，大部分是固缩的， 死亡的，只有一小部分是活细胞
人的羊水细胞能长成单层贴壁细胞克隆并可连续进行 传代培养
19
羊水细胞培养实验原理
培养条件：37℃,5%CO2 开放式培养 经过7天左右的培养，羊水细胞可生长为较成熟的细胞
3
产前诊断概念
产前诊断又称宫内诊断，是在胎儿出生前即对
其是否患有某种遗传性疾病或先天畸形做出准
确判断
无创性产前诊断技术
产前诊断
有创性产前诊断技术
4
产前诊断概念
无创性产前诊断技术
影像学检查（X线、超声、胎儿镜等），了解胎儿大体形态的发 育情况
母体外周血富集胎儿细胞技术 母体外周血胎儿游离DNA检测
8
哪些人需要进行产前诊断
唐筛高风险孕妇 35岁以上高龄孕妇 夫妇任一方为染色体病或染色体平衡易位携带者 曾生育过染色体异常患儿的夫妇再次妊娠 曾有不明原因自然流产、畸胎、死胎、死产或新
生儿死亡史的孕妇再次妊娠 采用辅助生殖技术妊娠者 夫妇一方有明显致畸因素接触史者
9
孕期胎儿染色体筛查方案
克隆，此时需更换培养液 换液后细胞进入指数增长期，此时细胞生长旺盛，在
换液后d1天及d2天在倒置显微镜下观察克隆生长情况， 适时加入秋水仙素终止培养
20
羊水细胞培养实验步骤
25ml羊水于1500rpm离心10min 小心弃上清后，用1ml羊水重悬沉淀 加入5ml完全羊水培养基，混匀 转入培养瓶中，拧松瓶盖，置于37℃,5%CO2 培养箱中
变时即用吸管吹打细胞，加入上清液终止消化 收集细胞悬液：1500rpm离心10min，去上清 低渗：加入0.075M KCl 6ml，吸管吹打，37℃水浴30min 预固定：加入1ml固定液（甲醇/冰醋酸=3/1），轻混匀，1500rpm
离心10min 固定：去上清，加入固定液8ml，轻混匀， 1500rpm离心10min 重复固定一次， 1500rpm离心10min，去上清 根据管底细胞量适当加入几滴新鲜固定液，滴片 显带、染色，显微镜下分析
率：5%
仅仅是筛查实验，不是确诊实验！
11
先天愚型的发生率与母亲年龄关系
母亲生育年龄（岁） 出生先天愚型患儿 风险率
＜20
1/1850
20-25
1/1600
25-30
1/1350
30-35
1/800
35-40
1/260
40-45
1/100
＞45
1/50
曾生育过先天愚型患儿 孕妇再发风险
增加5倍即1/370 增加5倍 即1/320 增加5倍 即1/270 增加5倍 即1/160
有创性产前诊断技术（介入性产前诊断技术）
绒毛膜穿刺、羊膜腔穿刺、脐带穿刺术等有创性操作 获得胎儿细胞进行遗传学分析，判断胎儿是否患有遗传性疾病
5
可进行产前诊断的疾病有哪些
遗传病
染色体病：染色体核型分析——金标准！
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）
10
唐氏筛查报告的解读
例如：21-三体风险率1/100 假阳性和假阴性
• 结合母亲年龄的三联筛查，唐氏综合症检出率: ≈ 65%，假阳性率：4.5-
5.0%
• 增加抑制素A，可以将检出率增加到75% • 结合母亲年龄的NT测量，21三体检出率：77%，假阳性率：5% • 结合生化分析和颈透明度的唐氏综合症的检测检出率可以达到89%，假阳性
15
脐静脉穿刺术
操作时间窗为18周至 分娩，妊娠20-24周为 最佳穿刺时期
其危险性高于羊膜腔 穿刺术和CVS
16
产前诊断主要实验室技术
羊水细胞培养及染色体核型分析 羊水细胞荧光原位杂交检测
（Fluorescence in situ hybridization，FISH ）
17
羊水细胞培养及染色体核型分析
正常男性染色体核型
正常女性染色体核型 23
21-三体男性染色体核型
21-三体女性染色体核型 24
羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测
原理： 经过荧光素标记的DNA探针，可特异性的与染色体 上与之互补的序列相结合，从而使染色体对应位置 上发出荧光信号
培养5~7天 一般7天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，
当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细 胞时，视情况（有较好的梭形细胞克隆）可换上完全 培养基，继续培养24-48小时 如细胞生长状况好，即可加入秋水仙素作用4-6小时左 右行细胞学处理。
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细胞收获及染色体制备实验步骤
倒出倒出瓶中细胞上清液入15ml离心管中 0.25% EDTA-trypsin消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改
无明显增加 无明显增加 无明显增加
12
产前诊断取材
绒毛膜穿刺术 羊膜腔穿刺 脐静脉穿刺术
13
绒毛膜穿刺术
在妊娠9-11周之间进行 一次绒毛活检获取20mg左右的绒毛组织可满足
任何产前诊断的需要 操作相关的流产率约为1%
14
羊膜腔穿刺术
孕18-24周 B超引导下 取羊水25-30ml
基因组病：SNP-array, array-CGH
单基因遗传病:PCR，基பைடு நூலகம்测序等 多基因遗传病：疾病易感基因研究
6
染色体异常的发生机率
活产婴儿
先天性智力障碍（MR）患者 先天性心脏病
0.6%
23% 13%
死胎和围产期死亡胎儿
6.0%
自然流产(前三个月)
60%
7
染色体异常的发生机率
21-三体综合征新生儿发病率高达1/800 18-三体发病率约为1/8000 13-三体发病率约为1/20000 其它各种性染色体异常发病率约为1/1000
产前诊断实验室技术
1
主要内容
一、产前诊断基本知识介绍 二、产前诊断的取材 三、产前诊断主要实验室技术
羊水细胞染体核型分析 羊水细胞荧光原位杂交
2
为什么要进行产前诊断
围生儿期常见疾病的发生率大大降低 遗传性疾病的发生率逐年提高 遗传病不能根治，不少遗传病病情严重，甚 至导致患儿死亡或终生残疾 产前诊断可及时诊断遗传性疾病，有利于积 极采取预防措施，减少遗传病患儿的出生， 降低遗传性疾病的发生率
18
羊水细胞培养实验原理
标本采集：一般为孕18～24 周，此时羊水中所含成纤 维细胞和上皮样细胞多，较易生长
羊水细胞是胎儿皮肤等的脱落细胞，大部分是固缩的， 死亡的，只有一小部分是活细胞
人的羊水细胞能长成单层贴壁细胞克隆并可连续进行 传代培养
19
羊水细胞培养实验原理
培养条件：37℃,5%CO2 开放式培养 经过7天左右的培养，羊水细胞可生长为较成熟的细胞
3
产前诊断概念
产前诊断又称宫内诊断，是在胎儿出生前即对
其是否患有某种遗传性疾病或先天畸形做出准
确判断
无创性产前诊断技术
产前诊断
有创性产前诊断技术
4
产前诊断概念
无创性产前诊断技术
影像学检查（X线、超声、胎儿镜等），了解胎儿大体形态的发 育情况
母体外周血富集胎儿细胞技术 母体外周血胎儿游离DNA检测
8
哪些人需要进行产前诊断
唐筛高风险孕妇 35岁以上高龄孕妇 夫妇任一方为染色体病或染色体平衡易位携带者 曾生育过染色体异常患儿的夫妇再次妊娠 曾有不明原因自然流产、畸胎、死胎、死产或新
生儿死亡史的孕妇再次妊娠 采用辅助生殖技术妊娠者 夫妇一方有明显致畸因素接触史者
9
孕期胎儿染色体筛查方案
克隆，此时需更换培养液 换液后细胞进入指数增长期，此时细胞生长旺盛，在
换液后d1天及d2天在倒置显微镜下观察克隆生长情况， 适时加入秋水仙素终止培养
20
羊水细胞培养实验步骤
25ml羊水于1500rpm离心10min 小心弃上清后，用1ml羊水重悬沉淀 加入5ml完全羊水培养基，混匀 转入培养瓶中，拧松瓶盖，置于37℃,5%CO2 培养箱中
变时即用吸管吹打细胞，加入上清液终止消化 收集细胞悬液：1500rpm离心10min，去上清 低渗：加入0.075M KCl 6ml，吸管吹打，37℃水浴30min 预固定：加入1ml固定液（甲醇/冰醋酸=3/1），轻混匀，1500rpm
离心10min 固定：去上清，加入固定液8ml，轻混匀， 1500rpm离心10min 重复固定一次， 1500rpm离心10min，去上清 根据管底细胞量适当加入几滴新鲜固定液，滴片 显带、染色，显微镜下分析
率：5%
仅仅是筛查实验，不是确诊实验！
11
先天愚型的发生率与母亲年龄关系
母亲生育年龄（岁） 出生先天愚型患儿 风险率
＜20
1/1850
20-25
1/1600
25-30
1/1350
30-35
1/800
35-40
1/260
40-45
1/100
＞45
1/50
曾生育过先天愚型患儿 孕妇再发风险
增加5倍即1/370 增加5倍 即1/320 增加5倍 即1/270 增加5倍 即1/160
有创性产前诊断技术（介入性产前诊断技术）
绒毛膜穿刺、羊膜腔穿刺、脐带穿刺术等有创性操作 获得胎儿细胞进行遗传学分析，判断胎儿是否患有遗传性疾病
5
可进行产前诊断的疾病有哪些
遗传病
染色体病：染色体核型分析——金标准！
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）
10
唐氏筛查报告的解读
例如：21-三体风险率1/100 假阳性和假阴性
• 结合母亲年龄的三联筛查，唐氏综合症检出率: ≈ 65%，假阳性率：4.5-
5.0%
• 增加抑制素A，可以将检出率增加到75% • 结合母亲年龄的NT测量，21三体检出率：77%，假阳性率：5% • 结合生化分析和颈透明度的唐氏综合症的检测检出率可以达到89%，假阳性
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脐静脉穿刺术
操作时间窗为18周至 分娩，妊娠20-24周为 最佳穿刺时期
其危险性高于羊膜腔 穿刺术和CVS
16
产前诊断主要实验室技术
羊水细胞培养及染色体核型分析 羊水细胞荧光原位杂交检测
（Fluorescence in situ hybridization，FISH ）
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羊水细胞培养及染色体核型分析