T-DNA插入突变及其研究进展
t-DNA插入突变体检测
2.2.3.7.取出凝胶，放入EB（溴乙锭，强突变剂，剧毒慎碰）染液中染色10-15分钟；
2.2.3.8.之后放入凝胶成像仪中，观察DNA跑胶的情况。
3.结果
3.1.第一次
TPS法提取44号样品DNA，以DL2000为Marker。
DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。不同浓度的琼脂糖凝胶对应线状DNA分子分离范围不同。（如下图）
本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确东样品是否为T-DNA插入突变纯和体。
PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。（PCR基本原理如右图）
4.2.实验分析
4.2.1.加液氮碾磨叶片时，最好保持离心管中始终有液体氮存在，如果碾磨一段时间后中途要加液氮继续碾磨，一定注意，液氮沸腾时极易将已经碾磨好的叶片吹走；另一点，碾磨时要迅速，避免空气中的水汽在离心管上凝结。
4.2.2.DNA有一定的物理脆性，所以在提取过程中混匀时一定要缓慢的摇晃，切忌剧烈震荡。
T-DNA插入鉴定实验报告
T-DNA插入突变体的鉴定时明辉同组者：薛敏学号：201000220069摘要 Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。
通过本实验，我们将学习如何用PCR的方法检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。
1.引言T-DNA作为一种实验常用的遗传转化方法，在插入突变过程中，插入到植物染色体上的位置是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA 插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确定样品是否为T-DNA插入突变纯和体。
PCR（Polymerase ChainReaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。
（PCR基本原理如右图）DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。
自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。
T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因的研究中期报告
T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因的研究中期报告
研究目的：
本研究旨在利用T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因，以深入了解水稻基因的功能和调控机制。
研究进展：
1.构建T-DNA(Ds)基因库
利用T-DNA插入物Ds，构建了一个水稻基因库。
通过PCR筛选，初步鉴定出有潜在功能的插入突变体共计500个，其中包括生长发育异常、叶片变异、花和果实发育受阻等表型。
2.筛选和鉴定候选基因
对上述500个插入突变体进行了细致的鉴定和筛选，最终确定了10个有潜在功能的基因。
使用RT-PCR技术检测了这些基因的表达情况，发现它们在水稻不同器官和阶段都有相应的表达。
3.克隆目标基因
在10个候选基因中，选择了其中表达量较高的一个基因进行深入研究。
通过PCR扩增、克隆和DNA测序，成功克隆出了该基因的DNA序列。
4.功能分析
利用生化和细胞学方法，对克隆出的基因进行了功能分析，发现其编码的蛋白质可能参与了水稻抗逆和光合作用等方面的调控。
进一步的实验证明了其参与抗逆和光合作用的功能。
结论：
本研究利用T-DNA(Ds)标签法成功克隆出了一个潜在的抗逆和光合作用相关的水稻基因。
该基因可能在水稻生长发育和逆境应答过程中起
着重要的调控作用，为深入了解水稻基因功能和调控机制提供了新的研究思路和方法。
同时，该研究还为今后利用T-DNA标签法克隆和研究其他作物基因提供了参考和借鉴。
拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
拟南芥TDNA插入突变
• 器材：离心机，离心管，PCR仪，点泳池，电泳现 象仪
（3）筛选纯和突变体 实验原理
双引物法
• 与“三引物法” 本质相同。 首先以基因组 D N A作为模板，用一对特异引物(LP和RP)扩增 目的基因片段，野生型和突变杂合体均一条带，纯合突变体 没有条带;然后再以基因组DNA 为模板，由T-DNA 片段的特异 引物(LB)与LP 或RP 组成一对引物，扩增目的基因T-DNA 插入 片,野生型没有条带，杂合体和纯合体一条410+N。 不足之处是完成最终鉴定需进行两轮P C R 扩增。
19
（3）筛选纯合突变体
实验方案设计
查看含有相关基因的种子信息
20
（3）筛选纯合突变体
实验方案设计
引物设计
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（3）筛选纯合突变体
实验方案设计
中间引物的设计
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（3）筛选纯合突变体
实验方案设计
两侧引物的设计
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（3）筛选纯合突变体
2、实验材料
• 赤霉素糖基转移酶基因的T-DNA插入突变种子：
The complex that comprises of the T-DNA bound to the binding protein then moves into the nucleus and is integrated into the nuclear genome.
7
2、反向遗传学的重要手段——T-DNA插入突变技术
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定余振洋（高山山、潘红芳）、09级生技1班、200900140156、2011/12/14摘要本实验通过CTAB法提取目的拟南芥的DNA，再用三引物法PCR扩增所需的目的基因后，用电泳检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。
关键词拟南芥;T-DNA；突变纯和体1．引言T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。
T—DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。
单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。
T—DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。
，T—DNA插入突变能方便地进行正向和反向遗传学研究，因而受到重视。
同时，基因组测序工作的完成使得从位点到表型的反向遗传学研究成为可能，从而使通过T—DNA插入技术构建突变体来研究功能的反向遗传学技术逐渐取代了传统的化学诱变、图位克隆等技术。
借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T—DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。
以T—DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。
由于插入的T—DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。
还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。
由此可见，T—DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。
CTAB法提取植物叶片中的DNA是我们常用的方法。
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档
模式植物拟南芥
拟南芥（Arabidopsis thaliana ）又称为阿拉伯芥，是一种十字花 科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典 型的模式植物。该植物具有以下特点：
植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵； 生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右； 种子多，每株可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培
养基就可作人工培养； 基因组小，只有5对染色体。 拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，
基因高度纯合。易获通过理化处理 获得各种功能的突变体。
外成像仪
实验步骤-拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使 种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的 培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置 于培养室内培养。
实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
1. CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇 =24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE
2. PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP） 、DNA模版、Taq DNA聚合酶
3. 电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
❖ 仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
每小组按10倍准备混合体系； 每个同学需做一颗植株的鉴定（两管PCR）。
LP: JDM17-1NR2 RP: JDM17-1F2 BP: LBb1.3
农杆菌介导的真菌T-DNA插入突变
真 菌 与人 们 的 生 活 和植 物 的生 长 有 着 不 可 分 割 的 作
用 。丝状 真 菌 的遗传转 化是 人们 进行基 因功能研 究 的重要
途径 ，其遗传 转化 体系 的建 立为人 们从 分子 水平 理解 丝状 真菌 的遗传 背景 、互作 模式及 进一 步 的菌株 改造 提供 了条 件。 为基 因的克 隆 、 表达及 调控 研究 奠定 了坚 实 的基 础并 提 供 了有效 的 手段 。 ｏｈ ｆｌ ｒ Ｒ ｃ ｅｅ ｅ 大学 的 Ｍｉ ｒ ｎ ａｕ ｌ ｓ ａａ ｄＴ ｔｍ利 用 ｈ
Ａｂ ｔａ ｔ Ａ ｏｔｎ ｃ ｎｑ ｅ ｇ ｎ ｔｔ ｎｈ ｓ ｅ ｎｕ ｅ ｔｄ ｎ ｏａｅ ｍｐ ｒ ｎ ｅ ｅ ． ｇ ｏ ａ ｔｒｕ ｔｍｅａ ｉｎ ａ ｅａ ｉ ｔ ｓｒ ｃ ： ｓａｉ ｒ ｔ ｅ ｈ ｉｕ ， ｅ ｅｍｕａｉ ａ ｅ ｓｄｔ ｓ ｙａ ｄｉ ｌｔ ｏｔ ｔ ｎ ｓ Ａ ｒ ｂ ｃ ｅｉｍ ｍｐ ａ ｔ ｏ ｂ ｏ ｕ ｓ ｉ ａ ｇ ｕ ｆｃｅ ｓｈ ｓ ｈ ｂ ｌ ｙ ｔ ｉ ｔ ａ ｓｅ ＮＡ ｔ ｌｎ ｅｌ ｂ ｅ ｅｉ ｎ ｉ ｅ ｒ ｇ ｉ ｄ ｆ ａｉｎ ａ ｅ ｅ ｔｎ ｅ ｈ ｏ ｔ ａ ｇ ｏ ｐ ａ ｔ ｔ ｂ ｃｅ ｕ ａ ｄｆ ｎ ｉ Ｈ ｎ ｅ ｏｔ ｎ ｆｒＤ ｐ ａ ｔ ｌ ｙｇ ｎ ｔ ｅ ｇ ｎ ｅ ｎ ， ｔ ｍｏ ｉｃ ｔ ｓｈ ｖ ｘｅ ｄ ｄ ｔ ｅｈ ｓ ｒｎ ｅｆ ｍ ｌｎｓ ｏ ａ ｔｒ ｍ ｎ ｇ． ｅ ｃ ， ｒ ｏ ｃ ｓ ｃ ｉ ｓ ｉ ｏ ｒ ｉ ｕ Ａｇ ｏ ａ ｔｒ ｍ ｕ ｆｃｅ ｓ ｍｅ ｉｔｄ ｇ ｎ ｔｔ ｎ ｉ ｏ ｅ ｏ ｅ ｍｕ ａ ｏ ｔ ｏ ｓｗ ｄ ｌ ｓｄ ｉ ｈ ａ ｔｓｖ ｒｌｙ ａ ｓ Ｉ ｅ ａｔ ｌ， ｈ ｒｂ ｃｅ ｉ ｔ ｍｅａ ｉｎ — ｄａｅ ｅ ｅ ｍｕａｉ ｓ ｎ ｆｔ ｔｔ ｎ ｍｅ ｄ ｉ ｅ ｕ ｅ ｎ ｔ ｅ ｌｓ ｅ ｅ ａ ｅｒ ． ｎ ｔ ｒ ｃｅ ｔ ｅ ｕ ｏ ｈ ｉ ｈ ｙ ｈ ｉ ｐ ｎ ｉｌ ｆ ｈ ｄ ａｉｎ ｔｅｒｓ ａ ｃ ｉ ａ ｏ ， ｅ ｔｒ ｙ ｅ ， ｘｓｅ ｒ ｂ ｅ ｎ ｓ ｅ ｓ ｉ ｔ ｌｗｅｅｉｔ ｄ ｃ ｄ ｉ ｒ ｃｐ ｅ ｅ ｏ ｔ ｍｅ ｉｔ ，ｈ ｅ ｒｈ ｓ ｕ ｔ ｎ ｖ ｃｏ ｐ ｓ ｅ ｉ ｄｐ ｏ ｌｍｓ ｄｉ ａ ｉ ｌｙａ ｒ ｒ ｕ ｅ ． ｏ ｅ ｔ ｉ ｔ ｔ ａ ｔｆ ｂ ｉ ｌ ｎｏ Ｋｅ ｒ ｓ ｉｓ ｒ ｏ ｔｔ ｎ Ｔ ＤＮ Ａ ＭＴ Ａ ｒｂ ｃ ｅｉ ｍ ｙｗｏ ｄ ： ｅ ｉｎｍｕ ａｉ ； — Ａ； Ｔ ｎ ｔ ｏ ； ｇ ｏ ａ ｔｒ ｕ
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定资料讲解
▪ 第一管：
▪
10xTaq buffer
min，再转移上清入新管。 5. 向上清液中加等体积的冷异丙醇，小心混匀。-20 ℃ 放置30 min，12000 rpm离心10 min，
弃上清。 6. 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 7. 将沉淀在超净工作台上吹干，或空气中晾干。加50 μl TE (pH 8.0)放4 ℃缓慢溶解。 8. 电泳检测DNA的浓度和质量。
▪
81.8 g NaCl
▪
0.2%(V/V)β-巯基乙醇
▪注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌后加入巯基乙醇
▪酚/氯仿/异戊醇： 25：24：1
▪氯仿/异戊醇： 24：1
▪TE缓冲液：Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L
▪3 M NaAc（pH 5.2）
左引物 LP： TCATCCACCATGGAAGAAAAG 右引物 RP：
TTGGATACGATGCGAGTAACC 中间引物LB: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用LP+RP产生大带：1107bp 用LB+RP产生小带：560-860bp
三、实验步骤
▪ 实验材料：拟南芥T-DNA插入突变体分 离群体30个株号的植株。
3. 用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体
▪ 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中， 有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在 突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分 离群体中将纯合突变体鉴定出来。
▪ PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三 个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上TDNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。 经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子 量较大的产物（野生型基因，大带）；在杂合突变体， LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大 带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小 带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小 的产物（小带）。因此，利用以上三种引物做PCR，根 据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。
实验五 拟南芥TDNA插入突变纯合体的鉴定
0.5 ml dNTP〔10 mmol/L〕
1 ml 046 5’引物〔10 mmol/L〕
1 ml 046 5’引物〔10 mmol/L〕
1 ml LBa 引物〔10 mmol/L〕
1 ml LBa 引物〔10 mmol/L〕
135号突变体的鉴定〔7-11组〕
30ml反响体系1：
30ml反响体系3：
实验五 拟南芥TDNA插入突变 纯合体的鉴定
实验目的
1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法； 2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突
变体的方法。
T-DNA插入鉴定的原理
突变体鉴定的步骤
1. T-DNA插入基因的基因组序列； 2. T-DNA插入方向确实定； 3. T-DNA插入位置确实定； 4. 引物设计； 5. PCR扩增； 6. 电泳检测。
条件下，离心5分钟； 〔6〕弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温下枯燥沉淀； 〔7〕100 ml TE溶解沉淀，将制备好的样品在4℃保存备用。
〔此方法提取的基因组DNA只适用于PCR的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增〕
PCR鉴定
30ml反响体系： 2ml 植物基因组DNA样品 3ml 10×扩增缓冲液 ml Taqase 〔5U/ml〕 0.5 ml dNTP〔10 mmol/L〕 1ml 引物1〔10 mmol/L〕 1ml 引物2〔10 mmol/L〕
1ml 135 5’引物〔10 mmol/L〕
1ml 135 3’引物〔10 mmol/L〕
1ml 135 3’引物〔10 mmol/L〕
30ml反响体系2：
30ml反响体系4：
2ml 植物基因组DNA样品〔WT〕 2ml 植物基因组DNA样品〔111〕
T-DNA
T-DNA插入突变具有受体材料范围广、操作简便、转化效率高、插入拷贝数少,转化子稳定等优点，是目前标记和获得植物病原真菌功能基因组的最有效的途径之一。
T-DNA插入突变也叫T-DNA标签(tagging)、(Agrobacterium tumefaciens 一mediated transformation，ATMT)，是根癌农杆菌介导的利用T-DNA作为插入突变原或分子标记，来分离或克隆因为插入而失活的基因并研究其基因功能的方法。
所谓的根癌农杆菌是指侵染植物根部的能诱发植物产生肿瘤的革兰氏阴性细菌，它们在自然状态下趋化性感染大多数双子叶植物的受伤部位，继而侵入根部细胞，最后在其中裂解，释放出Ti质粒，其上的T-DNA片段便会与植物细胞的核基因组整合，合成正常植株所没有的冠瘿碱(opines)，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转为癌细胞并诱导其产生冠瘿瘤。
1974年，比利时根特大学遗传学实验室的Zaenen观察到了农杆菌中的巨型质粒，并首次命名为Ti质粒。
后来发现这个约200kb的环状Ti质粒，主要包括毒性区(Vir区)、转移DNA 区(T-DNA区)、接合转移区和复制起始区这四个区域。
它能从致病植株转移到无病的植株中，使正常植株致病，T-DNA转移要穿越植物和细菌的细胞壁，再经过其原生质膜，最后穿透核膜。
主要包括4个过程：1)农杆菌首先识别植物敏感细胞再进行吸附和对信号的感受；2)Ti质粒上vir基因的激活；3) T-DNA切割以及T-DNA复合物的形成；4)新形成的T-DNA复合物从农杆菌转移到植物细胞中；5)整合T-DNA到植物的核基因并开始表达。
整个过程中，T-DNA自身并不编码任何与转移及整合有关的酶。
ATMT技术正是利用这一特性来携带外来基因进入植物细胞。
由于T-DNA两端各有一段25 bp的相对保守的同向重复序列，即T-DNA 边界序列。
将要转入植物细胞核的外源目的基因就是通过质粒构建的方法连接于这两段DNA区域之间。
插入突变在水稻功能基因组学中的研究进展
入突变、转座子插入突变等。主要介绍这两种方法的原理及其在水稻功能基因组学研究中的应用和进展，并分析和讨论了插 入突变在水稻功能基因组学研究中存在的困难和发展趋势。 关键词： 插入突变Ｔ－ＤＮＡ转座子 水稻功能基因组学
Ｓｔｕｄｙ
ｏｎ
ｔｈｅ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ
Ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ
Ｓｕ Ｈｏｎ９１・２
１２
ＡｄＤｓ系统插入和逆转录转座子插入法，如Ｔｏｓｌ７插 入建立水稻突变体库…。转座子可通过ＤＮＡ复制 或直接切除两种方式获得可移动片段，重新插入基 因组ＤＮＡ中。根据转座的自主性，这类元件又可分 为自主转座子和非自主转座子，自主转座子本身能 够编码转移酶而进行转座，而非自主转座子只有在 自主转座子存在时才能转座，如Ａｃ／Ｄｓ系统中，Ａｃ 属于自主转座子而Ｄｓ属于非自主转座子。逆转录 转座子是通过ＲＮＡ中间体进行转座的，这类转座子 转座后不需切割，因此能产生永久的突变。逆转录 转座子的主要特征是两端具有长的同向末端重复序 列（１０ｎｇ
ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｒｅｐｅａｔ，ＬＴＲ），ＬＴＲ主要携带有转录
起始和终止信号及转座所需的调控序列，在正常条 件下它们是失活的。逆转录转座子因其产生的插入 稳定，用于基因标记具有很大的潜力，如Ｔｏｓｌ７反转 录转座子已发展成为一个在水稻上很有希望的体 系。然而相对较低的转座频率限制了它们用于大规 模的基因标记。 Ａｃ／Ｄｓ系统是玉米中的一个转座子家族，广泛 应用于水稻插入突变体构建。Ａｃ因子单独存在便 可引起转座突变，但变异不稳定；Ｄｓ因子在有Ａｃ因 子或合成转座酶的序列存在的条件下才会引起插入 突变。Ａｃ／Ｄｓ因子以非复制的方式转座即所谓“切 粘”机制，但也会在染色单体间发生基因转换，使转 座子拷贝数增多，如水稻花粉育性相关的ａｉｄｌ突 变体‘８｜。 Ｔｏｓｌ７是水稻中第１个被鉴定的最有活性的逆转 录转座子，它在组织培养条件下可以被激活，且随培养 时间的延长其拷贝数会提高。实验表明Ｔｏｓｌ７在正常 繁殖的水稻品种中的拷贝数因随基因型而有所不同， 一般只有ｌ一５个拷贝；在组织培养下其拷贝数随继代 培养时间的延长而较快增加，当培养１６个月以后，其 拷贝数开始保持稳定；一般组织培养可使Ｔｏｓｌ７的拷贝 数增至５～３０，且Ｔｏｓｌ７只在组织培养条件下被激活，再 生植株的Ｔｏｓｌ７仍然是没有活性的一。。
水稻抗白叶枯病T-DNA插入突变体侧翼序列的分离和分析
２
华 中 农 业 大 学 学 报
第３ ２卷
ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ３ ． ０设计 引物 （ 表 １ ） ， 引 物 由 上 海 生 工 生 物 最后 ７ ２℃延 伸 １ ０ ａｉ ｒ ｎ 。
工程技术服务有限公司合成。
‘
１ ． ５ Ｐ ＣＲ － ｗ ａ ｌ ｋ ｉ ｎ ｇ方法
记录病斑 占叶片面积的百分率， 水 稻 突变 体 Ｇ４ ８和 对 照 日本 晴 （ Ｏｒ ｙ ｚ ａ ｓ ａ ｔ ｉ ｖ ａ 对病菌的抗感反应 ， 准［ 来分析植株的抗 、 感性。 Ｌ ． ｊ ａ ｐ ｏ ｎ ｉ ｃ ａ ｅ ｖ ． ｎ ｉ ｐ ｐ ｏ ｎ ｂ ａ ｒ ｅ ） 由 中 国农 业 科 学 院 路 根据抗感反应的分级标、 １ ． ３ Ｄ Ｎ Ａ的提 取 与 Ｓ ｏ ｕ ｔ ｈ ｅ ｒ ｎ杂 交 铁 刚研 究员 提 供 。
中图分 类号 Ｓ １ ８ ８ 文献标识码 Ａ 文章编号 １ ０ ０ ０ — ２ ４ ２ １ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ３ — ０ ０ ０ １ — ０ ７
植 物产生 突变体 的方法 主要有理 化诱 变、 Ｔ ＿
ＤＮＡ 插 入 、 转座 子 插 入 和 逆 转 座 子 插入 等 。利
图 １ 载体 ｐ Ｓ ＭＲ － Ｊ Ｉ ８ Ｒ的 结构
Ｆ ｉ ｇ ． １ Ｐ ｉ ｃ ｔ ｕ ｒ ｅ ｏ ｆ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｐ Ｓ ＭＲ — Ｊ Ｉ ８ Ｒ
． ２ 水 稻 白叶枯 病抗 性鉴 定 分析， 通 过 在 ＮＣ Ｂ Ｉ中进 行 序列 比对 ， 确定 Ｔ － Ｄ ＮＡ １ 水 稻 白叶 枯 病 抗 性 鉴 定 采 用 人 工 剪 叶 法［ １ ６ ］ 。 插 入 的确切 位 置 。
带有 Ｔ — Ｄ ＮＡ 的载体 ｐ Ｓ ＭＲ － Ｊ １ ８见 图 １ ， 载体 中 含有 标 记 基 因 Ｂ Ｏ ＧＵＳ ， 潮 霉 素 磷 酸 转 移 酶 基 因
T_DNA标签技术及其在植物功能基因组研究中的应用
T -DNA 标签技术及其在植物功能基因组研究中的应用杨永智(青海大学农林科学院,青海西宁 810016)摘要:综述了T -DNA 转移和整合机理的研究进展,植物T -DNA 标签的种类和特点及其在功能基因组研究中的应用。
关键词:T -DNA ;T -DNA 标签;植物功能基因组学;突变中图分类号:Q812 文献标识码:A 文章编号:1006-8996(2006)06-0034-06T -DNA tagging and its applicatlon in plantfunctional genome researchYANG Yong -zhi(Academy of Agriculture and F orestry Science ,Qinghai University ,X ining 810016,China )Abstract :This paper viewed the principle of T -DNA trans fer and integration ,the types and the charac 2ters of T -DNA insertion mutation in plant and the application of T -DNA tagging to plant functional ge 2nome research 1K ey w ords :T -DNA ;T -DNA tagging ;plant functional genomics ;mutantT -DNA 标签技术是以农杆菌(Agrobacterium )介导的转化为基础的一种插入突变研究方法。
插入突变是将某些DNA 元件插入到植物基因组中后,相应位点的基因的表达就可能受到抑制,利用插入元件作为标签,在插入位点处贴了一个标签,使得植物基因组的插入位点容易辨认。
根据插入位点的基因序列与植物表型变异等的相互关系可以从基因组中分离出相应的基因并鉴定其功能。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
➢植株形态个体小，高度只有30cm左右；➢生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；➢种子多，每株可产生数千粒种子；➢形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；➢遗传转化简单，转化效率高；➢基因组小，只有5对染色体，125MB；➢在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA 区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
利用 TAIL-PCR 分离申克氏孢子丝菌 T-DNA插入突变体侧翼序列的研究
利用 TAIL-PCR 分离申克氏孢子丝菌 T-DNA插入突变体侧翼序列的研究徐廷滔;白忠义;龙朋朋;张攀;于保东【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2014(000)009【总页数】4页(P1424-1427)【作者】徐廷滔;白忠义;龙朋朋;张攀;于保东【作者单位】吉林大学植物科学学院，吉林长春130062;吉林大学植物科学学院，吉林长春 130062;吉林大学植物科学学院，吉林长春 130062;吉林大学植物科学学院，吉林长春 130062;吉林大学中日联谊医院，吉林长春 130033【正文语种】中文申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)是双相型病原真菌，在自然条件下表现为菌丝相，而在体内和37℃为酵母相。
申克氏孢子丝菌引起人和动物的皮肤、皮下组织及其附近淋巴系统的慢性感染，称之为孢子丝菌病(Sporotrichosis)[1]。
该病常常与皮肤的轻微外伤后接触被病原菌污染的物质有关。
临床上孢子丝菌病分为淋巴管型、固定型及播散型。
其中最常见的是淋巴管型，引起皮肤渗出、化脓，甚至溃烂。
其次是固定型，常引起面部皮疹，多见于儿童。
虽然播散型孢子丝菌病发生率不高，但该病如不及时治疗，可引起死亡[2]。
近年来，随着抗肿瘤药物、抗生素等的广泛应用，以及恶性血液病和艾滋病等免疫受损人群的不断扩大，播散型孢子丝菌病呈上升趋势，严重威胁人类健康[3]。
随着后基因组时代的到来，迫切需要了解大量未知基因的功能。
农杆菌介导的T-DNA插入突变技术是通过反向遗传学研究基因功能的重要方法,在多种植物及真菌中已获得大量T-DNA插入突变体[4-6]。
而T-DNA插入位点侧翼序列的克隆是鉴定突变基因的关键步骤。
热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)由Liu和Whittier首先研究并报道[6]。
TAIL-PCR以基因组DNA 为模板，利用低退火温度的简并引物和高退火温度的特异性嵌套引物，通过低特异性PCR和高特异性PCR交替的三轮温度不对称循环，扩增获得特异性产物。
模式植物拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功 能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用 农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
2012.11.28
4
模式植物拟南芥
拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色体组 （n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色 体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样科 学家就可以准确定位插入DNA的位置。
DIFF_TM 0.55 LP TCTAGGAAATCGATCGGGTTC
Len 21 TM 60.40 GC 47.62 SELF_ANY_COMPL 0.55
3'_COMPL 0.00 RP GAGAGCATGTAAGGATGCTGG
Len 21 TM 59.85 GC 52.38 SELF_ANY_COMPL 0.55
模式植物拟南芥T-DNA插 入突变体的鉴定
201L2.O11G.2O8
目录
实验设计思路和原理
拟南芥的栽培
拟南芥T-DNA插入突变体 的PCR鉴定
2012.11.28
1
实验设计的思路和原理
经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研
究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是是在获得生物体基因组全部序列的
打开NCBI主页： http://www.ncbi.nl / 打开的页面如下： 在上面的search内查找 基因名称APETALA1：
从上面可以看到一共有19 个结果，其中第一个是拟 南芥中的，点击AP1：
根据上面的信息我们可以
得到基因在拟南芥内的系
统名称：AT1G69120
t-dna插入失活技术原理
t-dna插入失活技术原理t-dna插入失活技术是基因工程技术中的一种重要方法，它是利用外源DNA片段t-DNA 插入到目标基因中导致目标基因的失活从而研究基因功能的技术。
本文将分别从t-DNA插入原理、插入失活原理和t-DNA插入失活技术操作方法等方面进行详细介绍。
一、t-DNA插入原理t-DNA插入原理是指将来自农杆菌的具有植物感染活性的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）或农杆菌样细菌（Agrobacterium rhizogenes）分泌出来的Ti质粒或Ri质粒中的t-DNA随机插入到植物基因中，从而导致基因的失活或突变。
t-DNA（转移DNA）是一种由病原细菌通过T型四边形转移机制将其质粒中的特定DNA片段转移至植物细胞中的DNA。
t-DNA的大小和形状有很大的差异，但一般都包含左右边界（LB和RB）和一定的非编码序列。
通过LB和RB，t-DNA片段可以在植物基因组内随机插入到目标基因的某个位点中，从而会导致基因的失活或突变。
二、插入失活原理通常来说，t-DNA插入至基因区之下或之上才可能导致基因的失活或突变。
一旦t-DNA 片段成功插入至植物基因组的不适当位置上，将会导致基因的失活或突变。
在植物细胞中，t-DNA的LB和RB片段会被发现和被绑定到某些植物基因组中的端粒Repeat（telomeric repeat）上。
然后，t-DNA将和相邻的组织特异启动子、转录子或其他基因序列合并在一起，形成插入位点。
一旦t-DNA插入到目标基因中，其对目标基因的影响主要包括以下两种方式：第一是t-DNA插入至基因区之下，从而导致基因沉默或失活。
第二种是t-DNA插入至基因区之上，从而产生空穴（null alleles）或欠表达的突变形式。
三、t-DNA插入失活技术操作方法t-DNA插入失活技术是一种通过肆意插入t-DNA片段的方式探究植物基因功能的方法。
t-DNA的插入通常是随机发生的，因此需要通过重复筛选最终获得所需的突变体。
棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库的构建及其表型分析
Ａ ｓａｔＷ ｅ ｏ ｓ ｕｔｄａ ｔｎ ｌ ｒｒ ｙＡｇｏ ａｔ ｉｍ ｍｅａｉ ｓ ｄａｅ ａ ｓ ｒ ｔ ｎ （ ＭＴ， ｏｔｉｉｇ１０ ０ ｂｔ ｃ： ｎｔ ｃｅ ｍｕａｔｉ ａ ｂ ｒｂｃ ｒ ｒ ｃ ｒ ｂ ｙ ｅ ｕ ｔ ｆｃ ｎ— ｉ ｄ ｒｎｆ ｍａｏ ＡＴ ）ｃｎａ ｎ ５ ０ ｕ ｅ ｍｅ ｔ ｔ ｏ ｉ ｎ
峰
（ ． 河 子 大 学绿 洲 农 作 物 病害 防控 重 点 实验 室 ， 河 子大 学 ， １石 石 新疆 石河 子 ８ ２ ０ ； ． 国科 学 院微 生物 研 究 所 ， 物 基 ３ ０ ３ ２中 植
摘要 ： 以棉 花 强 致 病 力 黄 萎 病 菌株 Ｖ ９ ５ ２为 材 料 ， 用 农 杆 菌 介 导 的 Ｔ Ｄ Ａ 插 入技 术构 建 了 一个 含 １０ ０个 利 —Ｎ ５０ 转 化 子 的突 变 体 库 ， 突 变体 的 生 物 学特 性 、 病 力 及 ＴＤ 对 致 ． ＮＡ 插 入 拷 贝数 进 行 研 究 ， 果 显 示 ：１ 突 变 体 的 结 （）
文 章 编 号 ：０ ２７ ０ （ ０ ２ ０ —０ ２０ １ ０ ．８ ７ ２ １ ） １０ ６ ９
Ｃｏ ｓ ｒ ｃ ｉｎ ｏ － ｎ ｔｕ ｔ ｆａ Ｔ ＤＮＡ ｎ ｅ ｔ ｎ ＩＭｕ ａ ｔＬｂ ａ ｙ ｆ ｒＶ ｒ ｃｌｕ ｄ ｈｉｅ Ｋｌｂ ａ ｄ ｏ Ｉｓ ｒｉ ａ ｔ ｎ ｉｒ ｒ ｏ ｅ ｔ ｉｉｍ ａ ｌ ｅ ． ｎ ｏ ｉ ｌ ａ
Ａｎ ｌｓｓｏ ｔ ｎ ｅ ｏ ｙ ｅ ａｙ ｉ ｆａ Ｍｕａ ｔ Ｐｈ ｎ ｔ ｐ
Ｊ Ｐ ｉ ｏ ｇ， ＮＧ Ｌ— Ｚ Ｕ Ｂ ｎ － ｎ， Ｕ ｉ ｈ ｎ， Ｇ Ｏ Ｈｕ— ａ ＧＡ ｅｇ Ａ ｓ ｌ， ｕ ｓ