酵母菌药敏标准操作规程

酵母菌MIC检测标准操作规程（微量液基稀释法）

编号：页数：

制订人：（签名）（日期）

审核人：（签名）（日期）

批准人：（签名）（日期）

颁发日期：生效日期

1.培养基配置：

RPMI 1640 培养液：RPMI1640（Gibco BRL，Invitrogen）10g，NaHCO3 2.0g，吗啉基丙磺酸（morpholinepropanesulfonic acid, MOPS, Sigma）34.5 g（0.165 M），加三蒸水900 ml 溶解，1 M NaOH 调pH 至7.0（25℃），定容至1 000ml，过滤除菌，4℃保存。

沙堡葡萄糖琼脂培养基（sabouraud dextrose agar, SDA）：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900 ml 溶解，加入2 mg/ml 氯霉素水溶液50 ml，调整pH 至7.0，定容至1 000 ml，115℃，高压灭菌，4℃保存。

2.抗真菌化合物的配制：

（1）待筛选化合物统一用DMSO溶解，配成6.4mg/ml母液，-70℃保存；

（2）药敏板制备前将50μl母液加入到450μl RPMI 1640 培养液中，充分振荡混匀，稀释为640μg/ml 中间浓度备用。

3.药敏板制备：

（1）取无菌96 孔板，于每排1 号孔加RPMI 1640培养液200 μl 作空白对照；

（2）96孔板每排3～12 号孔各加RPMI 1640培养液100 μl；

（3） 2 号孔分别加RPMI 1640培养液180μl 和640μg/ml 抗真菌化合物溶液20 μl，充分混匀；每排为1个待筛选化合物；最后一排为质控氟康唑；

（4）2～11 号孔10 级倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、

2、1、0.5、0.25和0.125 μg/ml，各孔中DMSO 含量均低于1％；12 号孔不

含药物，作阳性对照；

（5）药敏板配好之后如不立即接种真菌则必须用保险塑料袋封好，储存于-70℃。

4.阳性对照药浓度配置：

（1）氟康唑和氟胞嘧啶为水溶性药物，其母液用无菌蒸馏水配置；两性霉素、咪康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、特比萘芬等为脂溶性药物，其母液用DMSO

溶解；

（2）氟康唑、氟胞嘧啶母液配置浓度为1280μg/ml，两性霉素、酮康唑、咪康唑、特比萘芬、伊曲康唑母液配置浓度为1600μg/ml；

（3）所有抗真菌药物母液-70℃保存；

（4）氟康唑、氟胞嘧啶药敏板稀释浓度为：64-0.125μg/ml；

（5）两性霉素、酮康唑、咪康唑、特比萘芬、伊曲康唑药敏板稀释浓度为：16-0.313μg/ml；

5.菌株准备：

（1）将受试菌株于SDA平皿上活化2次，以保证其活力；

（2）将活化菌株划线接种于SDA平皿，35℃培养24小时；

（3）挑取直径>1mm的菌落5个，将其溶解于灭菌三蒸水中，于振荡器上震荡15秒制备成菌悬液；

（4）用血细胞计数板将菌悬液浓度用RPMI 1640培养液调整至1×106~5×106(相当于麦氏浊度0.5)CFU/ml

计算公式：菌液浓度=5个中方格内细胞数×5×104

（5）将上述已经配置好的菌悬液用RPMI 1640培养液稀释1000倍(首先稀释50倍，然后稀释20倍)，使其浓度介于1×103~5×103 CFU/ml之间。

6.接种

菌悬液稀释至1×103~5×103 CFU/ml之间后，用多道移液器将菌液接终至96孔板第2~12号孔，最终接种浓度为0.5×103~2.5×103 CFU/ml；96孔板最后一排为质控菌株近平滑念珠菌ATCC22019。

7.培养：

新型隐球菌孵箱中孵箱中35℃培养72小时后观察结果，其他念珠菌35℃培养24小时后观察结果。

8.结果判读：

（1）吸光度测定判断法

酶标仪检测96孔板吸光度值，与阳性对照相比吸光度值下降80%为该化合物的最低抑菌浓度（MIC）；

与阳性对照相比吸光度值下降80%为唑类药物、氟胞嘧啶和棘白霉素类药物的最低抑菌浓度（MIC）；

与阳性对照相比吸光度值下降100%为两性霉素的最低抑菌浓度（MIC）。

（2）肉眼结果判定:

读取MIC 值时，应当在阅读镜的辅助之下，将每个受试孔中真菌的生长情况与生长对照孔相比较，进行评分，4 分示：生长无抑制；3 分示：生长轻微减少或相当于生长对照的75 %；2 分示：生长明显减少或相当于生长对照的50 %；1 分示:轻微生长或相当于生长对照的25 %；0 分示:肉眼观察澄清或未见生长。

筛选化合物MIC 值判定为相当于生长对照有50 %或更多的生长减少时的最低药物浓度(读数为2)。

两性霉素B MIC 值判定为没有可见生长(读数为0) 的最低药物浓度。若出现两性霉素B 拖尾的情况，临床上可能表现为耐药。

唑类药物、氟胞嘧啶和棘白霉素类药物MIC 值判定为相当于生长对照有50 %或更多的生长减少时的最低药物浓度(读数为2)。

（3）本实验室进行抗真菌化合物活性筛选实验结果判定时，应该首先进行吸光度测定判断MIC，并采用肉眼结果判定确认结果的可靠性。

9.质量控制：

每块药敏板第H行为质控菌株和质控化合物，其目的在于监测药敏试验的准确度、精密度、所用试剂、测试条件以及仪器的情况,保证试验者的操作以及结果的准确客观。

质控化合物采用氟康唑，质控菌株采用近平滑念珠菌ATCC22019。

近平滑念珠菌ATCC22019M IC参考值如下图所示，只有当其M IC值界于上述范围时，方认为试验操作准确可靠。如同时试验菌株生长良好,则可认为试验成功，结果可接受。

参考文献：

Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards: Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of Yeast.

Approved Standard, edn 3; Document M27-A3. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2009.