实时荧光定量PCR检测沙眼衣原体的研究

沙 眼 衣 原 体 （Chlamydia trachomatis，Ct） 引 起 的 泌尿生殖道感染，目前已成为常见的性传播疾病， 可导致男性尿道炎、附睾炎、直肠炎，女性感染能引 起宫颈炎、输卵管炎、盆腔炎和不孕等严重的后 果 。 ［1－2］ 沙 眼 衣 原 体 感 染 泌 尿 生 殖 系 统 ，常 缺 乏 特 异 的临床症状，大约 70％的女性宫颈炎和 50％的男性 尿 道 炎 感 染 可 无 临 床 症 状 ［3］，患 者 常 常 未 足 够 重 视 而不积极就医，错过治疗时机而造成不良后果。 因 此对沙眼衣原体感染进行快速、灵敏、准确的诊断， 不仅可限制疾病的传播，而且可减少不良后果的发 生。 沙眼衣原体外膜蛋白 A 基因（ompA）编码的主要 外 膜 蛋 白 （MOMP）， 约 占 整 个 外 膜 蛋 白 的 60％ ， 决 定 沙 眼 衣 原 体 的 型 和 特 异 性 ［4－5］。 本 研 究 采 用 定 量 PCR技 术 （TagMan 探 针 ），根 据 ompA 设 计 引 物 和 探
摘 要 ：目 的 采 用 TaqMan 探 针 建 立 检 测 沙 眼 衣 原 体 的 实 时 荧 光 定 量 PCR（real-time PCR）方 法 。 方 法 根 据 沙 眼 衣 原
体 外 膜 蛋 白 A 的 基 因 （ompA）序 列 设 计 引 物 和 探 针 ，以 克 隆 的 ompA 部 分 基 因 片 段 作 DNA 模 板 ，建 立 实 时 荧 光 定 量 检
表 1 沙 眼 衣 原 体 ompA 基 因 保 守 片 段 扩 增 引 物 Tab．1 Primers of Chlamydia trachomatis ompA gene for PCR
amplification
引物
引物序列
扩 增 片 段 （bp）
A1F 5′-GCGGCATTTGTAAACATCTCAG-3′ 508
2结果
2．1 沙眼衣原体 标准 DNA 的构建 沙眼衣原体阳 性样本通过 PCR 扩增后， 扩增产物经 1％琼脂糖电 泳，在 508 bp 处可见特异性条带（图 1）。 将 PCR 产物 与载体连接转化后得到的重组质粒测序分析比对为 沙 眼 衣 原 体 ompA 保 守 序 列 （图 2）。 使 用 Beckman Du 640 核酸定量仪测定 DNA 模 板 量 ， 本 次 实 验 的 DNA 模板为 150．7 μg ／ ml， 计算模板的拷贝数为 5× 1010 copies ／ μl。 2．2 敏感性分析 分别对 107、106、105、104、103、102、 101、100 copies ／ μl 的 标 准 DNA 作 荧 光 定 量 PCR 检
文献标识码： A
文章编号： 1672-3619（2013）06-0752-04
Detection of Chlamydia trachomatis by real-time PCR
LU Zhong-kui （Laboratory of Shunde Longjiang Hospital， Guangdong， Foshan 528318， China） Abstract： Objective In this study， we developed a real-time polymerase chain reaction （real-time PCR） based method for the detection of Chlamydia trachomatis． Methods The primers and TaqMan probes were designed based on ompA gene of Chlamydia trachomatis． Results For the quantitative real-time PCR， the relationship between the values of threshold cycle （Ct） and the DNA copy number was linear （r2＝0．997） and the sensitivity was at 5 copies ／ reaction． The sensitivity was about 100 times higher than the nested PCR． The real-time PCR reacted negatively to the genomic DNA of Chlamydia psittaci， Neisseria gonorrhoeae， Ureaplasma urealyticum， bacterial agents and human． Compared with nested PCR， the positive rate for the detection of clinical specimens was 100．00％， and the negative coincidence rate was 95．09％． Conclusion The developed real-time PCR is highly specific and sensitive for the detection of Chlamydia trachomatis． It can be used for the detection of Chlamydia trachomatis in cervical secretions from patients with suspected Chlamydia trachomatis infection． Key words： Chlamydia trachomatis； real-time PCR； ompA
具 有 特 异 性 强 和 敏 感 性 高 的 特 点 ，可 快 速 检 测 样 本 中 微 量 沙 眼 衣 原 体 DNA，适 用 于 对 沙 眼 衣 原 体 进 行 大 规 模 筛 选 。
关 键 词 ： 沙 眼 衣 原 体 ； 实 时 定 量 PCR； 外 膜 蛋 白 A
中 图 分 类 号 ： R374．1
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热带医学杂志 2013 年 6 月第 13 卷第 6 期 J Trop Med， Jun． 2013， Vol．13， No．6
·实 验 研 究 论 著·
实时荧光定量 PCR 检测沙眼衣原体的研究
陆中奎 （佛 山 市 顺 德 区 龙 江 镇 龙 江 医 院 检 验 科 ，广 东 佛 山 528318）
DNAቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ均 无 交 叉 反 应 ，表 明 该 方 法 具 有 良 好 的 特 异 性 。 以 巢 式 PCR 作 参 比 ，建 立 的 荧 光 定 量 PCR 法 检 测 沙 眼 衣 原 体 的
阳性符合率为 100．00％，阴性符合率为 95．09％，总符合率为 96．81％。 结论 建立的检测沙眼衣原体实时荧光定量PCR
作 者 简 介 ： 陆 中 奎 （1971 － ） ， 男 ， 本 科 ， 主 管 检 验 师 ， 从 事 医 学 检 验 工作
针，建立了快速检测沙眼衣原体的实时荧光定量 PCR 法。
1 材料与方法
1．1 材料 1．1．1 菌 株 与 DNA 鹦 鹉 热 衣 原 体 、淋 球 菌 、解 脲 脲 原 体 、金 黄 色 葡 萄 球 菌 （26066），出 血 性 大 肠 杆 菌 （O157H7 EDL933）DNA 样 本 由 广 东 省 疾 病 预 防 控 制中心惠赠。 345 例临床样本来自本医院检验科收 集的疑为非淋球菌性尿道炎或宫颈炎患者的阴茎口 或阴道分泌物。 1．1．2 主 要 试 剂 T 载 体 试 剂 盒 购 自 Takara 公 司 ； DNA 回 收 试 剂 盒 、 质 粒 提 取 试 剂 盒 和 全 血 基 因 组 DNA 提 取 剂 盒 均 购 自 天 根 生 化 科 技 （北 京 ）有 限 公 司 ； 荧 光 定 量 PCR 检 测 专 用 96 孔 板 和 盖 膜 以 及 TaqMan Universal PCR Master Mix 由 美 国 ABI 公 司 生产；引物、TaqMan 探针由上海生工公司合成。
测 方 法 。 结 果 建 立 的 荧 光 定 量 PCR 检 测 方 法 的 最 低 检 出 限 为 5 copies ／ 反 应 ，检 测 线 性 范 围 100～107 线 性 关 系 良 好
（r2＝0．997），比 巢 式 PCR 敏 感 100 倍 ；且 与 鹦 鹉 热 衣 原 体 、淋 球 菌 、解 脲 脲 原 体 、大 肠 杆 菌 等 病 原 菌 DNA 以 及 人 基 因 组
A1R 5′-AATAAGCCTAAAGGATATGTAGGGAAG-3′
TACGTGAGCAGCTCTCTCAT-3′），内引物为 CT-2F（5′TGACTTTGTTTTCGACCGTGTTTT-3′ ） 和 CT-2R （5′ TTTTCTAGATTTCATCTTGTTCAACTG-3′）。 巢式PCR 反 应 条 件 ：94℃ 5 min 1 cycle；94℃ 30 s，55℃ 30 s， 72℃ 45 s，35 cycles；72℃ 7 min， 取 5 μl 作为第2 次 扩增模板， 重复进行上述热循环步骤。 扩增产物经 2％ 琼脂糖凝胶电泳，大小为 879 bp。 1．2．4 临 床 样 本 DNA 的 提 取 采 用 天 根 生 化 科 技 （北京）有限公司生产的细菌基因组提取试剂盒（离 心柱法，货号：DP302）提取 DNA，测定 DNA 浓度。 1．2．5 临 床 样 本 的 检 测 分 别 用 5 μl DNA 样 本 作 模 板 进 行 定 量 PCR 检 测 和 巢 式 PCR 检 测 反 应 体 系。 同时设阴性和阳性对照。 PCR 全部过程做到标 本处理、PCR 扩增及产物检测三室分离，避免污染。
热带医学杂志 2013 年 6 月第 13 卷第 6 期 J Trop Med， Jun． 2013， Vol．13， No．6
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1．1．3 引 物 和 探 针 ABI Primer Express3．0 software 和 遵 循 TaqMan 探 针 设 计 原 则 ，根 据 沙 眼 衣 原 体 外 膜蛋白 A 基因（ompA）序列，设计引物 FOR Primer：5′CTTGCCACTCATGGTAATCAATAGA-3′，REV Primer： 5′-AAGGATATGTAGGGAAGGAATTTCC-3，探 针 ：5′CATCCTTAGTTCCTGTCGCAGCATCTGCTC-3′ ， 扩 增 片段为 99 bp。 1．2 方法 1．2．1 制 备 标 准 DNA 模 板 采 用 商 品 化 试 剂 盒 提 取 临 床 样 本 DNA， 采 用 PCR 方 法 扩 增 沙 眼 衣 原 体 ompA 基因保守片段 ，扩 增 所 用 的 引 物 见 表 1。 PCR 反应体系：15 μl 2×GC buffer、1 U rTaq（Takara），0．25 μmol ／ L 上 下 游 引 物 和 0．15 μmol ／ L 探 针 ，2 μl DNA 模 板 。 反 应 条 件 ：94℃ 5 min 1 cycle；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s 40 cycles；72℃ 7 min 1 cycles。 用 DNA 回收试剂盒从电泳后的琼脂糖胶上回收扩增的目的 DNA 片段。 依据试剂盒说明书，将纯化的目的 DNA 片段连接到 pMD19-T 载体上，该 T 载体克隆的经测 序 验 证 正 确 的 目 的 DNA 片 段 作 为 标 准 DNA 模 板 。 计算标准 DNA 模板拷贝数公式：DNA 拷贝 数＝DNA 含量 ／ 片段大小×615（Da）×1．67×10－24（gram）。 将标准 DNA 质粒以 10 倍倍比稀释至 107～100 copies ／ μl。