瑞氏吉姆萨复合染色液

外周血涂片的制作方法

1、采血：胶头滴管吸取血液，血液直接滴加到洗净烘干并且硅化过的载玻片的一头。

2、推片：将推片的平齐端置载玻片上血滴的稍前方，将推片略向后移使与血液相接触，血液遂于推片与载玻片的夹角间散开。以约30度的夹角向前均匀地推动推片即可制成血涂片。其薄厚度要适中，分布均匀而无空泡，边缘整齐。

3、固定：推片做好后，涂片后潮干固定，以免细胞漂落太多，影响制片质量，

甲醇固定液固定：涂片直接浸入固定液内，因固定液充足，固定效果较好。但细胞易脱落而发生交叉污染，因此应该分瓶固定，固定液回收时应过滤。多数标本用此法固定，固定时间15-30分钟。

4、染色：瑞氏-基姆萨双染

1）从固定缸里取出载片后，在室温下通风晾干。将载片平放在玻璃板上准备染色。

2）所用的两种染料事先过滤好（染料中有颗粒物，会沉淀在载玻片上影响载片的质量）

3）将染料滴加到载玻片上以后，让其均匀覆盖住载片上的血细胞，染色时间约为2到3分钟。等瑞氏染液有变红的趋势时，迅速滴加与瑞氏染液等量的PBS 溶液。继续染色2到3分钟。

4）染色时间到后，用PBS溶液冲片，小股水流，防止将大量的细胞从载片上冲落下来从而影响以后的观察。冲片结束后将载片放到阴凉处风干。

5）在玻璃板上放好牙签，将风干的载片倒扣在一根牙签上，从背面滴加基姆萨染液进行扣染。染色时间约为10分钟。时间到后用蒸馏水冲片，洗净染液后常温下风干。

5、封片：中性树胶封片，制作成永久涂片。

6、显微观察：将干燥后的血涂片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体、尾交界处的血细胞。在显微镜下，成熟红细胞染成粉红色；血小板染成紫色；中性粒细胞胞质染成粉红色，含紫红色颗粒；嗜酸性粒细胞含大的桔黄色颗粒；嗜碱性粒细胞胞质含有大量深紫蓝色颗粒；单核细胞胞质染成灰蓝色；淋巴细胞胞质染成淡蓝色。

所需材料：硅化过的载玻片，推片，甲醇瑞氏-基姆萨双染，过滤，PBS，牙签，蒸馏水，中性树胶，显微镜，吸耳球

1．载玻片使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。

2．推片选择边缘光滑的载玻片，在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm宽度的推片。

目的：制备厚薄适宜，分布均匀，染色良好的血涂片

问题：细胞分布不均，染色效果差，细胞破裂等。

表1-1 涂片质量不佳及可能原因

涂片质量不佳可能原因

不规则间断和尾部太长推片污染、推片速度不连续、载玻片太

脏

有空洞载玻片污染脂肪、油脂

白细胞和血小板尾部分布不规则制片技术差

涂片太长或太短推片角度不佳

涂片没有尾部血滴太大

涂片很短血滴太小

涂片没有边缘空隙推片太宽

有细胞退变现象固定延迟、固定时间太短、甲醇污染

血涂片厚血滴大、血粘度高、推片角度大、推片

速度快

白细胞破损推片时用力过猛

瑞氏（Wright）染色法：瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料,血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质. 细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。

基姆萨（Giemsa）染色法：基姆萨染液由天青，伊红（质）组成。染色原理和结果与瑞氏染色法基本相同。但本法对细胞核（蓝）和寄生虫着色较好，结构显示更不清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。即以稀释基姆萨液代替缓冲液，按瑞氏染色法染10min。或先用瑞氏染色法染色后，再用稀释吉姆萨复染。

表1-2 染色操作注意事项及操作不当的后果

操作注意事项操作不当的后果

加染液应适量过少则易蒸发沉淀，一旦染料沉积在血涂片上，

则不易冲洗，使细胞深染不易检查。

染料沉着在血涂片上

冲洗时不能先倒掉染液，应以

流水冲洗

冲洗时间不能过久脱色

剩余水分浸泡脱色

冲洗完的血涂片应立放于支架

上

（2）染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关。染液淡、室温低、细胞多则染色时间要长；反之，可减少染色时间。必要时可增加染液量或延长时间。冲洗前，应先在低倍镜下观察有核细胞是否染色清楚，核质是否分明。应该在具体实践中摸索合适的时间，特别是在更换染液时。每批染色液和缓冲液，均需试

染，以便掌握染色时间和加缓冲液的比例。

表1-3 染色质量不佳及可能原因

染色效

果

可能原因纠正措施

太蓝涂片太厚、冲洗时间太短、中性水pH 太高、染色时间太长、稀释染液重复

使用、贮存染液暴露于阳光在含1％硼酸的95％乙醇溶液冲洗2次，用中性水冲洗，待干镜检

太红冲洗时间太长、中性水pH太低、贮存染液质量不佳、涂片干燥前加封片规范操作。新鲜配置中性水。保证染液质量不佳

太淡染色时间太短、冲洗时间太长复染。应先加缓冲液，后加染

液，或加染液与缓冲液的混合

液，不可先加染液

染料沉积染料沉淀、染液未过滤、涂片太脏用甲醇冲洗2次，并立即用水

冲掉甲醇，待干后复染

蓝色背固定不当、涂片未固定贮存过久、使注意涂片的固定。使用EDTA 40%甲醛：PBS =1:3

多聚甲醛：固体