内生真菌原生质体制备与再生条件研究

内生真菌原生质体制备与再生条件研究摘要本文通过对一株产紫杉醇菌株的原生质体的制备与再生

影响因素的研究，结果显示，菌株原生质体制备、再生的最佳条件是2%纤维素酶+3%蜗牛酶组成的复合酶系，30℃，以0.7mol/l nacl 为渗透压稳定剂，酶解时间为6h ，原生质体的得率为5.30?？07个/ml。在28℃，0.7mol/l nacl为渗透压稳定剂的再生培养基中避光再生培养2d ，原生质体的再生率约为25.63 %。

关键词内生真菌原生质体制备再生。

引言

紫杉醇（taxol）是一种复杂的具有抗癌活性的二萜生物碱，在临床上用于治疗多种恶性肿瘤。紫杉醇产生菌是周东坡等从东北红豆杉韧皮部分离到的一种内生真菌，紫杉醇产量经hplc测定为51.06 -125.70 g/l ，较1993年以前报道的其它菌种发酵单位高。

在工业微生物领域，将药用菌原生质体诱变技术应用于遗传育种，不仅可以缩短育种时间，降低工作量，而且还可达到改良菌种性状、创造出新的优良性状的效果。本文通过研究影响紫杉醇产生菌原生质体的分离与再生的酶系统及菌龄，从而筛选出适合的原生质体分离与再生的条件，为其诱变育种奠定基础。

一、材料与方法

（一）材料

1、供试菌种产紫杉醇taxol-8菌株，由陕西国际商贸学院微生物与免疫实验室提供。

2、培养基 pda液体培养基；pda固体培养基；再生培养基。

3、酶解液 2.00﹪纤维素酶；2.00%蜗牛酶；不同比例的纤维素酶和蜗牛酶组合酶系。

4、试剂渗透压稳定剂： 0.7mol/l nacl，ph6.0；工具酶：蜗牛酶、纤维素酶。

5、仪器与设备恒温振荡器；高速低容量冷冻离心机；光学显微镜。

（二）方法

1、菌种活化配制母种培养基，分装试管，于121.3℃灭菌30 min后放置斜面， 28℃培养后，4℃冰箱备用。

2、液体培养制备液体培养基分装，30 ml/100 ml，于121.3℃灭菌30 min，种接，28℃恒温培养24h后，1000 r/ min 振荡培养。

3、收集菌丝体抽滤发酵液得菌丝体，以无菌水和渗透压稳定剂各洗涤3次（5min/次）。

4、原生质体制备将菌丝体置于1ml的离心管中，按1：3（菌丝体湿重g：酶液体积ml）的比例，30℃，ph6.0的条件下进行酶解。酶解过程中每隔1h振荡1次，使酶解液均匀，反应期间每隔1h吸取少量酶解液镜检，观察原生质体产生情况。4500 r/ min离心10 min后弃去上清液，用稳渗剂洗2次后重新悬浮于0.7mol/l nacl的稳渗剂中，镜检，计数。

原生质体制备率（fp）=原生质体个数（np）/酶解液体积（v）

5、原生质体再生取原生质体悬液200 l置于再生培养基，将

原生质体用无菌水低渗处理作对照，于28℃下培养2d，镜检计数，求再生率。

再生率=（再生菌落数- 对照处理再生菌落数）/镜检原生质体数/ml?？.2?？00%.

二、结果与分析

（一）紫杉醇产生菌原生质体的制备

1、不同种类酶液对原生质体制备率的影响按1︰3（菌丝体湿重g：酶液体积ml）的比例将菌丝体（培养9d）加入到不同种类酶液中，30℃，ph6.0的条件下酶解6h。不同种类酶液对原生质体产率的影响见表1。