大肠埃希菌检查法

大肠埃希菌检查法

Escherichia Coli T est Method

1.目的

建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。

2.范围

适用于大肠埃希菌检查的操作。

3.责任者

QC化验员。

4.程序：

4.1.简述

4.1.1. 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。

4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。

4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。

实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG 鉴别大肠埃希菌其漏检率达6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG 与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。

4.2.仪器、设备及用具

4.2.1. 无菌室

4.2.2. 净化工作台

4.2.3. 培养箱(36±1℃)

4.2.4. 高压蒸汽灭菌器

4.2.

5. 显微镜(1500X)

4.2.6. 微波炉

4.2.7. 恒温水浴（45±1℃）

4.2.8. 离心机(500～4000r/min)

4.2.9. 0.45μm±0.02μm薄膜及过滤器

4.2.10. 电冰箱

4.2.11. 匀浆仪

4.2.12. 366nm紫外灯

4.2.13. 玻璃器皿、器具

4.3.试液、指示液

4.3.1. 0.9％无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。

4.3.2. 靛基质试液取氯化二甲氨基苯甲醛

5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95％乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。

4.3.3. 甲基红指示液取甲基红0.1g，加95％乙醇300ml，使溶解后加水至500ml，即得。

4.3.4. V-P试液

α-萘酚乙醇试液：取α－萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。

氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g、加水使溶解成100ml。

4.3.

5. 革兰染色液

4.3.

5.1. 结晶紫染液取结晶紫1.0g、95％乙醇20ml、1％草酸铵[(NH4)2C2O4]溶液80ml。将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混合，静置48h，置密闭棕色瓶，可存放数月。

4.3.

5.2. 革兰碘液碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml。用少量水溶碘化钾，再加碘，待全溶后，加蒸馏水至30ml，置棕色瓶备用。

4.3.

5.3. 脱色液95％乙醇

4.3.

5.4. 沙黄(番红)染液沙黄(SafranineO)0.25g、95％乙醇10ml、蒸馏水适量，将沙黄加入乙醇中，完全溶解后再加水至100ml。

4.3.6. 亚甲蓝指示液取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。

4.3.7. 溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水稀释至100ml。变色范围pH6.0～7.6(黄→红)

4.3.8. 酸性品红指示液取酸性品红0.5g，加水100ml溶解，再逐渐加1mol/L 氢氧化钠溶液16ml，每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水中保持15分钟，静置2小时，滤过，即得。变色范围pH6.0～7.4(黄→红)。

4.3.9. 曙红钠指示液取曙红钠2.0g，加水溶解使成100ml。

4.3.10. 无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液取聚山梨酯80 1ml加0.9％氯化钠溶液使成100ml，121℃灭菌20分钟。

4.3.11. 无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) 取磷酸氢二钠2

5.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20分钟。

4.3.12. 无菌对氨基苯甲酸试液取对氨基苯甲酸0.1g，加入含10ml水的具塞

试管中，121℃灭菌20分钟。

4.3.13. 中性红指示液取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。变色范围

Ph6.8～8.0（红→黄）。

4.3.14. 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0) 取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，加热使溶解，过滤。分装，灭菌。

4.4.培养基

4.4.1. 营养肉汤培养基

胨10g 氯化钠

5.0g

牛肉浸出粉 3.0g 水

1000ml

取上述成份混合，微温溶解，调解pH为弱碱性，煮沸，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。

4.4.2. 营养琼脂培养基

胨10g 氯化钠

5.0g

牛肉浸出粉 3.0g 水

1000ml

琼脂14.0g

取上述成份混合，微温溶解，调解pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。

4.4.3. 胆盐乳糖培养基（BL）

胨20.0g 磷酸二氢钾 1.3g

乳糖 5.0g 牛胆盐 2.0g

氯化钠 5.0g （或去氧胆酸钠）(0.5g)

磷酸氢二钾 4.0g 水1000ml

除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH 值使灭菌后为7.4±0.2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。

4.4.4. 4-甲基伞形酮葡萄糖化酶苷酸（4-methylumbellifery1-β

-D-glu-curonide,MUG）培养基

胨10.0g 磷酸二氢钾（无水）0.9g

硫酸锰0.5mg 磷酸氢二钠（无水） 6.2g

硫酸锌0.5mg 亚硫酸钠40mg

硫酸镁0.1g 去氧胆酸钠 1.0g

氯化钠 5.0g MUG 75mg

氯化钙50mg 水1000ml

除MUG外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入MUG，溶解，每管分装5ml，灭菌。

4.4.

5. 曙红亚甲基蓝琼脂培养基（EMB）

营养琼脂培养基100ml 曙红钠指示液2ml

20%乳糖溶液5ml 亚甲蓝指示液 1.3-1.6ml