(最新)免疫学检测技术的基本原理
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④化学发光免疫技术
将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新 的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺。
灵敏度高、简便、可实现自动化分析。
20
⑤免疫胶体金技术
1. 用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab的方法。 2. 氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的
疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。 3. 该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。
1:8
1:16
12
间接凝集反应
将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进 行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O” 试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测。
凝集反应常用于溶血性疾病的诊断：
+
病人的RBC 体内anti-Rh
7
四、抗原抗体反应检测技术的应用
抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合 适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可 呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗体存在 于血清中，故又称血清学反应。
8
五、抗原-抗体反应的基本检测方法
抗原抗体反应
凝集反应
沉淀反应
蛋白芯片 技术
2
第一节 基于抗原-抗体反应的检测方法
一、抗原抗体反应概念
抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在 合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结 合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗 体存在于血清中，故又称血清学反应。
3
二、抗原抗体反应的特点
1.高度特异性 可精确区分物质间极微细的差异。 表示为 亲和力：一个抗原表位与相应抗体单一抗原 结合位点间的结合能力。 亲合力：指一个抗体分子与整个抗原大分子 间的结合强度，与抗原表位数目有关。
来自百度文库
+
由于抗体多属于IgG，分子 量较小，抗体与红细胞间的 结合力不能克服细胞间的排 斥力，不出现凝集
体外加入 抗人IgG
出现凝集现象， 叫直接库姆试验
+
正常人O型血 患者血清内的 的Rh+的RBC 游离anti-Rh
+
体外加入 抗人IgG
出现凝集现象，
叫间接库姆试验
13
2.沉淀反应
毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉 淀物，称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。
细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况 下直接反应，二者比例合适时，出现肉眼可见的凝集团现象。
玻片法
常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定
直接凝 集反应
试管法
1:2稀释待测血清 1:4
选择最佳稀释浓度， 常用于检测抗体的滴 度或效价，见于临床 诊断伤寒或副伤寒所 用的肥达氏反应和诊 断布氏菌病所用的瑞 特试验。
用于荧光底物发光，通过
检测荧光强度判断未知抗
原的含量。
17
e) 免疫组化技术
定位、定性、定量检测
18
②免疫荧光技术
19
③放射免疫测定
用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将 同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来， 具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、 药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。
直接凝集 间接凝集
免疫比浊 单向免疫扩散
双向免疫扩散
免疫电泳
免疫标记
荧光 酶
同位素 化学发光 胶体金 免疫印迹
9
Ag-Ab反应的原理
特异性
高亲和力
Ab
结合力的表示方法 亲和力和亲合力
低亲合力
Ag
低亲和力
Ab
高亲合力
Ag 10
Ag-Ab反应的可见性
Ab 过剩
Ag 过剩
比例适当，交联成网络
11
1.凝集反应
Ab in gel
单向免疫扩散
Ag
Ag
Ag
Ag
用于确定 抗原浓度
免疫比浊
过量Ab Ab
Ab
Ab
双向免疫扩散
Ag1 Ag2
Ag3
Ag4
Ab
鉴定多种抗原是完全相同、 部分相同或完全不同
14
沉淀反应—免疫电泳
存在于不同区域的抗原与抗 体结合，在比例适宜处形成 沉淀弧。沉淀弧的数量、位 置和形状与标准品相对比， 可分析样品的成分及其性质。
抗原抗体反应的2个阶段 第1阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完 成；第2阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较 大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。
6
三、抗原抗体反应的影响因素
1.电解质 抗原抗体等电点分别为pH3-5和pH5-6，在中性或 弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解质会使 它们失去一部分负电荷而相互结合； 2.温度 通常为37℃，适当提高反应温度可增加抗原与抗体 分子的碰撞机会，但56℃以上可使抗原或抗体变性失活； 3.酸碱度 抗原抗体反应的最适pH值在6-8之间，pH值过高 或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。当pH值接近等 电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现 凝集，导致非特异性反应。
免疫学检测原理
免疫学检测是指借助免疫学、细胞生物学、 分子生物学等理论或方法，对抗原、抗体、 免疫细胞及细胞因子等进行定性、定量检测。 临床医学中，免疫学检测可用于免疫相关疾 病的诊断、病情检测和疗效评价等。
1
本章内容
第一节 基于抗原-抗体反应的检测方法 第二节 免疫细胞检测 第三节 分子生物学技术在免疫学上的应用
21
⑥免疫印迹法-Western blotting
22
4.蛋白质芯片技术
又称为蛋白质微列阵，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微列阵。 根据蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。
15
3.免疫标记技术
① 免疫酶测定法 ② 免疫荧光技术 ③ 放射免疫测定法 ④ 免疫胶体金技术
16
①免疫酶测定法
a) 夹心法ELISA
b) 间接ELISA
a）
c) BAS—ELISA 利用生物
素和抗生物素蛋白为桥梁
d) 微粒捕获酶免疫分析技术
将已知特异性抗体致敏的
免疫微粒与生物素、亲和
b）
素、酶相结合，最后酶作
4
2.抗原抗体结合的带现象与可见性
抗原抗体结合存在带现象（前带、等带、后带），适宜的抗原抗体浓度和比例 （等带）决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应；
5
3. 表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键、范德华力 和疏水键等非共价结合。易受温度、酸碱度和离子强度的影 响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性，可借助亲和层 析法纯化抗原或抗体。
将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新 的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺。
灵敏度高、简便、可实现自动化分析。
20
⑤免疫胶体金技术
1. 用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab的方法。 2. 氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的
疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。 3. 该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。
1:8
1:16
12
间接凝集反应
将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进 行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O” 试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测。
凝集反应常用于溶血性疾病的诊断：
+
病人的RBC 体内anti-Rh
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四、抗原抗体反应检测技术的应用
抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合 适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可 呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗体存在 于血清中，故又称血清学反应。
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五、抗原-抗体反应的基本检测方法
抗原抗体反应
凝集反应
沉淀反应
蛋白芯片 技术
2
第一节 基于抗原-抗体反应的检测方法
一、抗原抗体反应概念
抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在 合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结 合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗 体存在于血清中，故又称血清学反应。
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二、抗原抗体反应的特点
1.高度特异性 可精确区分物质间极微细的差异。 表示为 亲和力：一个抗原表位与相应抗体单一抗原 结合位点间的结合能力。 亲合力：指一个抗体分子与整个抗原大分子 间的结合强度，与抗原表位数目有关。
来自百度文库
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由于抗体多属于IgG，分子 量较小，抗体与红细胞间的 结合力不能克服细胞间的排 斥力，不出现凝集
体外加入 抗人IgG
出现凝集现象， 叫直接库姆试验
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正常人O型血 患者血清内的 的Rh+的RBC 游离anti-Rh
+
体外加入 抗人IgG
出现凝集现象，
叫间接库姆试验
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2.沉淀反应
毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉 淀物，称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。
细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况 下直接反应，二者比例合适时，出现肉眼可见的凝集团现象。
玻片法
常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定
直接凝 集反应
试管法
1:2稀释待测血清 1:4
选择最佳稀释浓度， 常用于检测抗体的滴 度或效价，见于临床 诊断伤寒或副伤寒所 用的肥达氏反应和诊 断布氏菌病所用的瑞 特试验。
用于荧光底物发光，通过
检测荧光强度判断未知抗
原的含量。
17
e) 免疫组化技术
定位、定性、定量检测
18
②免疫荧光技术
19
③放射免疫测定
用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将 同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来， 具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、 药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。
直接凝集 间接凝集
免疫比浊 单向免疫扩散
双向免疫扩散
免疫电泳
免疫标记
荧光 酶
同位素 化学发光 胶体金 免疫印迹
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Ag-Ab反应的原理
特异性
高亲和力
Ab
结合力的表示方法 亲和力和亲合力
低亲合力
Ag
低亲和力
Ab
高亲合力
Ag 10
Ag-Ab反应的可见性
Ab 过剩
Ag 过剩
比例适当，交联成网络
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1.凝集反应
Ab in gel
单向免疫扩散
Ag
Ag
Ag
Ag
用于确定 抗原浓度
免疫比浊
过量Ab Ab
Ab
Ab
双向免疫扩散
Ag1 Ag2
Ag3
Ag4
Ab
鉴定多种抗原是完全相同、 部分相同或完全不同
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沉淀反应—免疫电泳
存在于不同区域的抗原与抗 体结合，在比例适宜处形成 沉淀弧。沉淀弧的数量、位 置和形状与标准品相对比， 可分析样品的成分及其性质。
抗原抗体反应的2个阶段 第1阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完 成；第2阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较 大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。
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三、抗原抗体反应的影响因素
1.电解质 抗原抗体等电点分别为pH3-5和pH5-6，在中性或 弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解质会使 它们失去一部分负电荷而相互结合； 2.温度 通常为37℃，适当提高反应温度可增加抗原与抗体 分子的碰撞机会，但56℃以上可使抗原或抗体变性失活； 3.酸碱度 抗原抗体反应的最适pH值在6-8之间，pH值过高 或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。当pH值接近等 电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现 凝集，导致非特异性反应。
免疫学检测原理
免疫学检测是指借助免疫学、细胞生物学、 分子生物学等理论或方法，对抗原、抗体、 免疫细胞及细胞因子等进行定性、定量检测。 临床医学中，免疫学检测可用于免疫相关疾 病的诊断、病情检测和疗效评价等。
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本章内容
第一节 基于抗原-抗体反应的检测方法 第二节 免疫细胞检测 第三节 分子生物学技术在免疫学上的应用
21
⑥免疫印迹法-Western blotting
22
4.蛋白质芯片技术
又称为蛋白质微列阵，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微列阵。 根据蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。
15
3.免疫标记技术
① 免疫酶测定法 ② 免疫荧光技术 ③ 放射免疫测定法 ④ 免疫胶体金技术
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①免疫酶测定法
a) 夹心法ELISA
b) 间接ELISA
a）
c) BAS—ELISA 利用生物
素和抗生物素蛋白为桥梁
d) 微粒捕获酶免疫分析技术
将已知特异性抗体致敏的
免疫微粒与生物素、亲和
b）
素、酶相结合，最后酶作
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2.抗原抗体结合的带现象与可见性
抗原抗体结合存在带现象（前带、等带、后带），适宜的抗原抗体浓度和比例 （等带）决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应；
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3. 表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键、范德华力 和疏水键等非共价结合。易受温度、酸碱度和离子强度的影 响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性，可借助亲和层 析法纯化抗原或抗体。