普通PCR及测序PCR原理解剖

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30个 循环
PCR的特点
1. 特异性强 2. 灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能 将皮克(pg=10 - 12)量级的起始待测模板扩增 到微克(g=10 -6)水平 3. 简便、快速 PCR反应一般在2～4 小时完成扩增反应。扩 增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素， 无放射性污染、易推广
（5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ体系中dNTP、EDTA 等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
（6）缓冲液（Buffer）
原 因
1. 模板:含有抑制物，含量低
2. Buffer对样品不合适
3. 引物设计不当或者发生降 对
解
策
4. 反应条件：退火温度太高，延
伸时间太短
1. 纯化模板或者使用试剂盒提取 模板DNA或加大模板的用量
2. 更换Buffer或调整浓度 3. 重新设计引物（避免链间二聚
特点：1.良好的耐热性 在70～80℃具有最高聚合活性 在95 ℃仍然可以有50%活性
2. Mg2+依赖性 3. 扩增时3‘末端凸出一个A 碱基 3. 无校正功能
一般PCR中酶的用量为0.5-2.5 U/50 l，酶量增加使反应 特异性下降，酶量过少影响反应产量。
（3）引物
引物浓度：0.1-0.5 mol/L
反应体系（50 ul）：
Taq酶
2.5 U
10x Buffer
5 ul
dNTP(2.5mM) 4 ul
DNA模板
0.1～2ug
上游引物(10P) 2 ul
下游引物(10P) 2 ul
H2O
补足至50 ul
总计
50 ul
反应流程（以扩增片段大小为
800bp为例）：
95℃ 95℃ 55℃ 72℃ 72℃ 4℃
一 PCR技术
PCR概念 PCR的原理 PCR中的注意事项 PCR的主要类型
什么是PCR?
• 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称 ＰＣＲ技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外 扩增特异ＤＮＡ片段的技术。 PCR技术操作简 便，可在短时间获得数百万个特异的目的ＤＮ Ａ序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明， 引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广 泛应用于与分子生物学相关的各个领域。
10mmol/L TrisHCl 调节PH，使Taq酶活性作用 环境维持在扁碱性（pH8.3,室温）
50mmol/L KCL 有利于引物的退火，但过高会 抑制Taq酶活性
0.01% 明胶 保护酶不变性失活
2）循环参数
(1)变性
使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒
(2) 退火
退火温度由引物Tm值决定，一般为 Tm – 5~10℃
（6）两引物间避免有互补序列。
（7）引物3’端与模板序列要严格配对，3’端避免出现
3个或3个以上连续相同的碱基 ；引物 5’端无严格限
制。
3’
5’
5’
3’
限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记
（4）dNTP
dNTP： dATP， dTTP， dGTP， dCTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则 降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影 响DNA聚合酶的活性。
PCR反应的几个要素
• DNA聚合酶 • 模板（要扩增的DNA） • 引物
• dNTPs • Buffer（缓冲液） • Mg 2+ 等
生产机器 模具
原料 稳定的环境
润滑剂
PCR反应步骤 95℃（变性） 50℃（退火） 72℃（延伸）
PCR循环（25-35个）
变性(denaturaion) 模板DNA
第3轮扩增（8）
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 上下游引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
PCR反应条件
1）PCR反应成分 （1）模板
模板可以是DNA，也可以是RNA（反转录PCR）， 既可以是双链，也可以是单链。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、 DNA结合蛋白类。
一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）Taq DNA聚合酶（Taq酶）
DNA聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、dNTP等 存在的情况下催化DNA的合成。
Taq酶来自水生嗜热菌 Thermus aquaticus
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下 降。
引物设计： （1）引物序列特异性好，与非扩增区无同源性。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占40-60%。 （4）引物Tm在50℃-65℃之间，两条引物的Tm应接
近，不能相差太大。
（5）引物内部避免形成二级结构。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降 低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸 70-75oC(温度取决于聚合酶的活性） 延伸时间由扩增片段长度及DNA 聚合酶的延伸速度决定
（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加
一个典型PCR体系
95℃
退火(annealing)
引物2
DNA引物
引物1
50℃
延伸(extension)
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
72℃
95℃
第1轮结束 第2轮开始
模板DNA（1） 第4轮扩增（16）
第5轮扩增（32=25）
第1轮扩增（2） PCR的基本原理
•第2P轮CR扩反增应（条4）件 • PCR过程 • PCR的特点
4.对标本的纯度要求低：
不需要分离病毒或细菌及培养细胞， DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽 液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA 扩增检测
PCR常见问题
• 假阴性，无扩增产物
• 非特异性扩增 • 拖尾 • 假阳性
• 无扩增产物
➢现象：正对照有条带，而样品则无；