流式细胞检测方法

Annexin Ⅴ-FITC 细胞凋亡试剂盒使用（细菌）

K：不加菲A：5000ug/L菲B: 500ug/L C: 500ug/L

1、在0,24,48,72h取样3ml，测定OD600

2、在0,24,48,72h取样，三个平行各取1ml,混匀，6000r/min,离心20分钟，弃上清，收集细胞，用5mlPBS轻轻重悬（注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。）

3、实验组（4组）：取K、A、B、C组重悬的细胞，加入5mg/ml的溶菌酶2ml,35℃水浴30Min,6000r/min,离心10分钟，弃上清。

4、实验组：各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。加入10μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入100μl碘化丙啶，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。

5、阳性对照组：取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min（杀死细胞）,然后加入100μl 碘化丙啶（PI）单染，轻轻混匀，另1管加入10ul Annexin V-FITC单染，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。

6、阴性对照组：另取1份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml，混匀，不加任何染色剂。

7、将样品过400目筛网，进行流式细胞仪检测。

8、Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

9、因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

10、用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。Annexin V-FITC 的绿色荧光通过FITC 通道（FL1）检测；PI 红色荧光通过PI 通道（FL2 或FL3）检测，建议使用FL3。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

二醋酸酯荧光素（FDA）与碘化丙啶的流式细胞术

1、在0,24,48,72h取样3ml，测定OD600

2、在0,24,48,72h取样，三个平行各取1ml,混匀，6000r/min,离心20分钟，弃上清，收集细胞，用5ml PBS轻轻重悬

3、取K、A、B、C组重悬的细胞，加入5mg/ml的溶菌酶2ml,35℃水浴30Min,6000r/min,离心10分钟，弃上清。

4、实验组：各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。加入200μl FDA，轻轻混匀；再加入100μl碘化丙啶，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。

5、阳性对照组：取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min（杀死细胞）,然后加入100μl 碘化丙啶（PI）单染，轻轻混匀，另1管加入200ul FDA单染，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。

6、阴性对照组：另取1份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml，混匀，不加任何染色剂。

7、将样品过400目筛网，进行流式细胞仪检测。

8、二乙酸荧光素( FDA) 本身无荧光。在细胞的非特异性脂酶的催化下, FDA生成荧光素, 后者经480 nm激光激发出波长530 nm左右的绿色荧光。死细胞的细胞膜不完整, 生成的荧光素很快扩散出细胞, 不能检测到带有绿色荧光的细胞。碘化丙锭( P I) 不能进入具有完整细胞膜的活细胞, 当细胞死亡或细胞膜不完整时, P I进入细胞, 与DNA相结合, 在488 nm的激光激发下, 在波长660 nm左右检测到红色荧光。因此, 通过FDA /P I双染色的方法, 利用死活细胞在经染色后会激发出不同波长的荧光的特点, 即活细胞可检测到FDA产生的荧光信号, 而无P I产生的荧光信号, 死细胞则相反, 这样就可以将死活细胞区分开来。