地高辛标记系统

Dig-High Prime DNA标记及检测试 剂盒理想条件下标记产量
Template DNA 10 ng 30 ng 100 ng 300 ng 1000 ng 3000 ng 1h 45 ng 130 ng 270 ng 450 ng 850 ng 1350 ng 20 h 600 ng 1050 ng 1500 ng 2000 ng 2300 ng 2650 ng
杂交液的准备和杂交温度的计算
DiG Easy Hyb：将64ml 无菌去离子水分两 部分倒入试剂7#瓶（DiG Easy Hyb Granules)，37 ºC摇动溶解5分钟 计算杂交温度：通常为37 ºC -42 ºC Tm=49.82+0.41(%G+C)- (600/I)(I=length of hybrid in base pairs)。 Topt.=Tm-20 to 25 ºC
杂交
预热一定体积的DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至杂交 温度37-42 ºC 。 预杂交30分钟。在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液 中42 ºC下充分润湿。（此过程可以延长至数小时） 变性：Dig标记的探针（约25ng/ml）加50µl H2O置沸水浴 或98 ºC干浴锅中5分钟后迅速放在冰上冷却。（不能用碱 变性！） 将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2） 中，混匀，避免泡沫。 倒出预杂交液，加入探针和DIG Easy Hyb混合液。 继续在42 ºC下杂交6h 至过夜（单拷贝探针）。
探针标记效率检测
目的是确定杂交中使用正确的探针量，探 针用量太多会引起背景太深，用量太少则 无杂交或杂交很弱（探针浓度：25ng/ml杂 交液）
检测流程
将地高辛标记好的探针系列稀释，点到一 条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120ºC固定30分钟； 用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色 步骤显色； 比较显色结果，选择带有可以接受的背景 的最高探针浓度做正式的杂交。
地高辛标记的dUTP
地高辛标记系统的特点
标记和检测技术安全 标记的探针稳定可以保存一年 杂交液可以反复使用数次
与放射性同位素标记方法相同之处
标记和杂交技术相似 高灵敏度 低背景 可以标记DNA、RNA 或Oligonucleotides
与放射性同位素标记方法不同之处
无害,安全 产生的废物不需特殊处理 需要分析的时间短 探针稳定
地高辛标记与检测的原理
利用不同的方法将Digoxigenin-11-dUTP掺入到新 合成的探针DNA 或RNA链中或寡核苷酸的末端 探针与目标DNA杂交后，用连接有碱性磷酸酶或 其它偶联物的地高辛的抗体检测地高辛标记的探 针 根据地高辛抗体连接的偶合物不同，利用荧光检 测（anti-DIG-fluorescein，rhodamine)、化学发 光检测(anti-DIG-AP and CSPD or CPD-star)或显 色（anti-DIG-AP and NBT/BCIP or other substrates))的方法将探针杂交的位置显现出来
DNA的地高辛标记和检测步骤
探针DNA 的标记及标记效率测定 DNA的转移和固定 杂交 免疫测定 洗去膜上探针再次杂交
操作基本要求
工作环境及试剂要干净：（1）试剂要高 压灭菌；（2）含有SDS 的试剂要过滤灭 菌；（3）TWEEN20应加到预先灭菌过的 试剂中 用具要干净：用之前一定要清洗得非常干 净 操作尼龙膜时要小心（1）戴无尘手套； （2）用干净的镊子夹取膜的边缘
2 15 5 5 5 5 5 0
198 35 45 45 45 45 45 50
1:100 1:3.3 1:10 1:10 1:10 1:10 1:10 -
10 pg/µl 3 pg/µl 1 pg/µl 0.3 pg/µl 0.1 pg/µl 0.03 pg/µl 0.01 pg/µl 0
步骤
将上述稀释的2-9 号管的control DNA 及探针DNA各取1µl 点膜 120ºC固定30分钟或紫外交链 将膜放入装有20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室 温2分钟 将膜放入10ml Blocking solution中室温温育30分钟 将膜放入10ml Antibody solution 中室温温育30分钟 用10ml Washing buffer 洗2次，每次15分钟 在10ml Detection buffer 平衡2-5分钟 将膜放入2ml 新配制的Color substrate solution 中暗室条 件下显色。显色过程中不要摇动。 当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟， 照相
备注：
含有探针的DiG Easy Hyb杂交液可重复 利用，杂交结束后放入离心管中于-20 ºC 保存，可重复使用几次，只需在使用前 于68 ºC处理10分钟即可 不要煮沸DiG Easy Hyb杂交液
试剂准备（1）
Washing buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20. 15-25℃ stable. Removal of unbound antibody. Maleic acid buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; adjust with NaOH(solid) to pH 7.5(20℃)0 15-25℃ stable. Dilution of Blocking solution. Detection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5(20℃). 15-25℃ stable. Ajustment of pH to 9.5. TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0. 15-25℃ stable. Stopping color reaction.
预杂交注意事项
预杂交的目的是用非特异性DNA分子（鲑 精DNA）及其它高分子化合物（封闭剂） 将待杂交膜中的非特异性位点封闭，从而 减少杂交背景。 预杂交及杂交时保证buffer覆盖膜 如果尼龙膜要多次探测，务必保证在任何 时候都不要让尼龙膜干燥
杂交液组成
5×SSC (NaCl，柠檬酸钠 × ，柠檬酸钠) 50mM PB (NaH2PO4，Na2HPO4) ， 5×Denhardt (多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，BSA) 多聚蔗糖， × 多聚蔗糖 聚乙烯比咯烷酮， 2.5mmEDTA （有/无） 无 100ug/ml SS DNA (鲑精 鲑精DNA) 鲑精 0.1%SDS 10%硫酸葡聚糖（dextran sulfate） 硫酸葡聚糖（ 硫酸葡聚糖 ）
探针的标记
地高辛标记系统
Leabharlann Baidu
常用标记物分类
放射性同位素标记 非放射性标记 荧光素标记 生物素标记 地高辛标记
地高辛（DIG）是灵敏度高、非放射性核酸 标记检测体系。DIG检测灵敏度接近同位素 而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊 检测设备，相比生物素则没有样本内源干 扰之苦，很适合用于核酸非放标记检测。
标记步骤(20µl)
将10ng-1µg 模板DNA用无菌去离子水补足至16µ l。 沸水浴或干浴98 ºC 10分钟，使DNA变性成单链并 迅速冰浴冷却。 充分混匀DiG-high Primer （1#管），并取4 µ l至 变性DNA管，混匀并离心。 37 ºC温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。 停止反应，加2 µ l 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 ºC 加热10分钟。
探针模板DNA的要求
质粒DNA纯度要高。最好用高纯度的质粒DNA 分离和纯 化试剂盒纯化质粒模板或用苯酚/氯仿抽提去除残留的蛋 白质。纯化后的模板用H2O 溶解 用作探针模板的DNA应是线型的，大于100bp，如果模板 DNA >5kb则应用4碱基的限制性内切酶切割成较小片段 （切割后要纯化） 模板的量：10ng-3µg，如果要检测复杂基因组中的单拷贝 基因，标记模板的最低量要300ng（探针浓度：25ng/ml 杂交液） 如果做基因组DNA southern blotting, 应将克隆倒载体上 的DNA 酶切后琼脂糖电泳分离或PCR扩增，得到的片段 都需要用试剂盒纯化
试剂准备（2）
Blocking solution :用Maleic acid buffer 10×稀释试剂6# （10×Blocking solution ），成1×的工作液，即每9ml Maleic acid buffer中加入1ml 10×Blocking solution 混匀， 现配现用。封闭膜上非特异性结合位点 Antibody solution(Ab) solution : 将4#试剂离心，按1： 5000或1：10000加入Blocking solution，2-8 ºC可放12小 时。（每10ml Blocking solution 加1ul Ab抗体即可）.与 地高辛标记的探针结合。 Color-substrate solution（显色液）：从试剂 5#(NBT/BCIP)中取100ul到5ml Detection buffer，要避光， 现配现用。显示抗体结合的位点
随机引物标记
利用随机引物标记的方法将 Digoxigenin11-dUTP掺入到新合成的DNA 链中。 反应体系中包含六碱基随机引物、dNTP(含 有碱性条件下不稳定的Digoxigenin-11dUTP，Klenow 酶及反应所需的Buffer
DIG-dUTP:dTTP的理想比例1：3 20-25bp 可插入一个DIG-dUTP 随机引物法标记的探针是基于模板的不同 区段、不同长度的DNA 片段 可以探测0.03-0.1pgDNA
探针定量
根据上表探针标记的理想产量将标记的探 针稀释到1ng/µl. 例如：起始模板用1µg，20µl体
系1h 后，查前表可知其理想标记量是850ng，则探针的理 想标记浓度为850ng/20 µl =42.5ng/µl; 则取1µl标记产物 +41.5µl H2O 混匀后即得到1ng/µl探针稀释液.
定量结果分析
染色至0.1pg的Control DNA出现斑点，比较 标记的探针与Control DNA 染色情况计算出 地高辛标记的DNA 的量。
如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想 如果0.1pg的对照显色， 0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg显 色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多 少探针（25ng探针/ml杂交液） 如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则 应重新标记探针
将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/µl (原始浓度是5ng /µl)
Tube From tube# 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Diluted orginal 1 2 2 3 4 5 6 -
DNA (µl) DNA
dilution buffer(µl)
Dilution Final concentration 1ng/µl
探针标记效率低的原因及解决办法
1. 标记条件不合适
重新标记，但将标记时间延长至过夜 用相同量的模板标记，但体系放大，体系 中的其它成分相应放大 模板放在沸水中变性
2. 模板不纯
只用高纯度模板 用推荐的试剂盒准备模板 纯化模板：用苯酚/氯仿抽提后用酒精沉淀
DNA 的转移和固定
固定：2 × 的SSC短暂洗涤膜后 120ºC 30 min 或80ºC 2h；或者将膜放在用10× 的 SSC 浸湿的滤纸中UV-Crosslinkering 不马上使用的尼龙膜放在2-8 ºC干燥保存
本次实验标记步骤(10µl)
将300ng 模板DNA用无菌去离子水补足至8 µ l。 沸水浴或干浴98 ºC 10分钟，使DNA变性成单链 并迅速冰浴冷却。 充分混匀DiG-high Primer （1#管），并取2 µ l 至变性DNA管，混匀并离心。 37 ºC温育1小时或过夜（最大到不超过20小 时）。 停止反应，65 ºC加热10分钟。