荧光定量PCR之绝对定量分析 标准曲线的绘制

荧光定量P C R之绝对定量分析——标准曲线的绘制1. 绝对定量定义

绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。

将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。

* Log(起始浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系

* 由样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量

2. 绝对定量标准品

标准品的一些标准

* 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同

* 标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）

* 标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数）

* 在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值

标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化

后的PCR产物，当然也可以是基因组DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。

3. 标准品的制备

一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。倍比梯度稀释方法：

1v原液（标准品i）+9v稀释缓冲液，得标准品ii

1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii

1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv

1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v

依次倍比稀释

拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算

4. 实例

标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700 测得其拷贝数1.55×108copy /ul 标准曲线的绘制（1cycle=1min）

设置对照：浓度为1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、1.55×101的标准样品各一个，设空白对照

PCR反应：以不同浓度标准品作为模板

标准品的扩增曲线

标准品的溶解曲线

标准品的标准曲线图

扩增效率（E）计算：

E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04，E%=(2.04-1)×100%=104%

若未知样本的CT值为19.11，将CT值代入线性方程：

即19.11=34.29-3.23X，所以X=(19.11-34.29)/(-3.23)=4.7 Quantityunknow=104.7=50118 copies

核酸拷贝数的计算

一、分步推理如何计算核酸拷贝数

1A260吸光度值=dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml 核酸浓度＝(OD260)×(dilution factor)×[33或40或50]=ng/ul

MW代表克/摩尔，单位dolton：1dolton即表示1g/mol

1摩尔=6.02x1023摩尔分子(拷贝数)

平均分子量(MW)：dsDNA=(碱基数)×(660道尔顿/碱基)

ssDNA = (碱基数)×(330道尔顿/碱基) ssRNA=(碱基数)×(340道尔顿/碱基)

得到拷贝数计算公式：(6.02x1023拷贝数/摩尔)×(浓度)/(MW g/mol)= copies/ml.

即(6.02x1023)×(g/ml)/(DNA length×660)=copies/ml.

或(6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×660)=copies/ul.

例：3000碱基质粒，浓度100 ng/ul

MW=3000bp×660dalton/bp=1.98×106daltons，即1mol=1.98×106g

(100ng×10-9)g/1.98×106＝摩尔数

copy数＝摩尔数×6.02×1023＝3×1010copies/ul.

二、这是一个小小的计算器，使你计算更加方便快捷，免去算数之苦……

http://www.bioask.me/html/541.html

什么是拷贝数？ /html/540.html

如何计算拷贝数？

计算方法：(6.02×1023拷贝数/摩尔) × (浓度g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

[平均分子量(MW g/mol)：dsDNA=(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；ssDNA=(碱基数)×(330道尔顿/碱基)；ssRNA=(碱基数)×(340道尔顿/碱基)]