酵母表达系统所需实验材料

一、菌种
1.大肠杆菌
一种克隆感受态（JM109，DH5α，TG1，TOP10）
2.毕赤酵母菌.
GS115,甲醇利用正表型(Mu+)。

培养基含有甲醇时，菌正常生长，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子中，Mu+和Muts两种表型都有，需要在MM 和MD培养基上鉴定表型，转化整合效率高。

KM71H, 甲醇利用慢表型(Muts)。

培养基含有甲醇时，菌生长比野生株缓慢，组表达载体转化KM71H后，长出的转化子中，都是Muts表型，不需Mu表型鉴定。

SMD1168(Mu+)，蛋白酶缺陷型宿主菌，降低了目的蛋白被蛋白水解酶降解的风险。

二、毕赤酵母菌分泌表达载体
诱导型启动子：pPIC9K，采用α因子信号序列，含卡那抗性基因，可用遗传霉
素筛选外源基因多拷贝转化子。

（无标签）
pPICZαA，采用α因子信号序列，具有博来霉素抗性基因，易于筛选阳性多
拷贝转化子。

（有标签）
组成型启动子：pGAPZα，采用α因子信号序列，具有博来霉素抗性基因，易
于筛选阳性多拷贝转化子。

（有标签）
另外，大肠杆菌表达载体pCold也可以进行诱导分泌表达蛋白。

三、实验试剂
限制性内切酶EcoRI，NotI，NcoI，Sac I，T4DNA连接酶，Takara公司
G418（遗传霉素），葡萄糖，生物素，甲醇，山梨醇，甲醛，咪唑，Na2S203，
酵母氮源(YNB)，含His的补充培养基，
酵母基因组DNA纯化试剂盒，大肠杆菌质粒提取试剂盒，0.2μm无菌滤膜。

四、实验简要计划
用软件对pET28a-重组人胰岛素质粒进行EcoRI，NotI，NcoI酶切位点分析发现，NotI 在NcoI位点的上游，并且都是单酶切位点。

所以可以通过EcoRI和NotI对重组大肠杆菌质粒双酶切获取目的基因，这对目的基因的阅读框无影响。

通过EcoRI和NotI对酵母表达载体双酶切，可以获得载体片段。

将获得的载体片段与目的基因用T4 DNA连接酶4摄氏度连接过夜，并转化到大肠杆菌克隆感受态中，在抗生素培养基
中培养，提取质粒进行酶切及PCR鉴定正确后，送去测序。

测序正确后，证明获得重组酵母表达阳性质粒，并将阳性质粒电转化到GS115感受态中，PCR鉴定正确后，在抗性基因及选择标记的培养基中筛选正确并蛋白高表达量的重组酵母菌。

实验试剂
1.限制性内切酶NotI ，NcoI，Sac I ，T4 DNA连接酶，各一支（Takara 公司）
2. 葡萄糖，生物素，甲醇，乙醇，山梨醇，甲醛，咪唑，Na2S203，甘油，醋酸钠，碳酸钠，磷酸氢二钠，氯化钠，冰乙酸，49．5％丙烯酰胺，Tricine，G418，组氨酸（His）各一瓶。

3.酵母氮源(YNB)一瓶（BD公司，货号291920原装500g），含His的补充培养基一瓶，
4.酵母基因组DNA快速抽提试剂盒一盒（上海生工，货号B518227-0100），大肠杆菌质粒提取试剂盒两盒（上海生工，货号B518191-0100）。

5. 无菌0.2μm滤膜过滤器，100个。

6. 毕赤酵母菌GS115 Invitrogen公司。

7.DNA Marker 15000一支（大连宝生物，货号3582A）。

8.非预染蛋白电泳Marker一支（Themo公司，货号26632）
9.蓝盖试剂瓶：1000mL ，500mL，250mL，100mL各8个。

10.20mL医用灭菌注射器100支。