第三章-荧光分析

一、基本装置及主要部件功能
光 源 单色器
激发单色器
ex
I0
Ia 样品池 If 单色器
发射单色器
It
em
记录仪 检测器
1. 光源
作用：提供稳定、发射强度大的辐射
常见光源：
①荧光光度计，以溴钨灯(300～700nm)为光源。 ②荧光分光光度计，以氙灯(250～600nm)为光源。
2. 单色器
本章小结
一、分子荧光基本原理
物质受到光照射时，吸收某种波长的 光之后还会发射出比原来所吸收光的波长 更长的光，这种现象称为光致发光，最常 见的光致发光现象是荧光和磷光。
激发
hv
激发态
去激发
hv f 基态
内转换 S2
振动弛豫 体系间跨越 T2
T1 发 射 荧 光
S1
能 量
外转换
发 射 磷 光
S0
通过有机化合物与金属离子形成配合物
HO
OH
HO
O
OH
C
O C O
C
O C O
酚酞
荧光素
f=0
f = 0.92
-OH N
Mg
-O N Mg1/2
8-羟基喹啉 弱荧光
8-羟基喹啉镁
强荧光
分子的刚性共平面使荧光效率增大：
①分子共平面越大，共轭程度越高。
②分子共平面越大，刚性越强，振动越 小，与其他分子发生碰撞造成无辐射 跃迁几率减小。
5. 读出装置
①记录仪 ②阴极示波器 ③显示器
光 源
单色器
样品池 If 单色器
It
记录仪
检测器
2．荧光光度计与紫外－可见分光光度计区别：
（1）两个单色器，分别在样品池前后：激发单色 器（第一单色器）、发射单色器（第二单色器） （2）样品池：紫外可见光被吸收（池）、荧光发 射（池）
（3）激发光源（入射光）与荧光检测器相互垂直 放置。可避免入射光或透过光对微弱荧光的干扰。
2）标准比较法
若样品数量少，可用标准比较法测定
Cs
Cx Cs Cx
=
Is
Ix Is -If0 Ix -If0
Cx =
Ix
Is Ix -If0 Is -If0
Cs
=
Cx =
Cs
第四节
分子荧光分析的应用和技术
荧光分析的特点
（1）灵敏度高 （2）选择性强 （3）试样量少 缺点：应用范围较小。
一、无机物的分析
第二节
影响分子荧光的因素
1. 荧光效率f
发射荧光分子数 f 被激发分子总数
Or:
发射光量子数 f 吸收光量子数
f 表示分子产生荧光的能力。
荧光效率与激发态能量释放过程的 速率常数有关:
f
k f ki
kf
k -荧光发射过程速率常数
f
k -各种无辐射跃迁速率常数之和
二、激发光谱、荧光发射光谱
激发光谱：固定荧光发射波长(em)，改变 激发波长（ex）， 以激发波长为横坐标、 荧光强度（If）为纵坐标绘制关系曲线。 荧光发射光谱：固定激发波长(ex)，改变 发射波长（em），以发射波长为横坐标， 荧光强度（If）为纵坐标绘制关系曲线。
特点：
①发射光谱形状与激发波长无关
若A<0.05, 方括号内第一项以后的项可忽略不计：
I f = 2.3 f I0 A
或
I f = 2.3 f I0 cl
对于确定物质、激发波长和I0一定时，荧光强 度与溶液的浓度成正比，即：
I f = kc
2. 分子荧光定量分析方法 1）标准曲线法
配制一系列不同浓度的标准溶液，测定荧 光强度，绘制标准曲线，在相同条件下测量未 知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。
+ HCl
DNAS-Cl
DNAS-NHR
三、分析条件的选择
1.仪器校正
（1）波长
荧光光度计长期使用，或更换检测器等重 要部件，可用汞灯标准谱线对单色器波长进行 校正。
（2）灵敏度
在选定波长及狭缝宽度的条件下，用某 种稳定的荧光物质配成标准溶液进行校正。 若被测物质的荧光很稳定，也可用作标准溶 液对仪器的灵敏度进行校正。
常见荧光熄灭剂：
卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化 合物、重氮化合物、羰基化合物等。 发生碰撞而使之失去能量 生成不发光的化合物
溴、碘以及溶解氧的存在，实现体系 间跨越，转变成三重态
荧光自灭：荧光物质浓度增大时，荧光强度减弱
第三节
荧光光度计及荧光测量
分类：
荧光光度计：色散元件为干涉滤光片
荧光分光光度计：色散元件为光栅
利用化学反应使一些不能产生荧光的化合 物转变成荧光物质； 或将芳香族化合物与适当荧光试剂反应， 生成强荧光物质，可提高方法的灵敏度，
方法：增大分子共轭体系或增加刚性
常用的化学反应方法
1）氧化还原反应
血浆中苯妥英：二氯乙烷萃取，再转入NaOH 溶液中，用KMnO4氧化成二苯酮，二苯酮在H2SO4 作用下产生强荧光（ex=360nm，em=490nm）。
（4）取代基效应（芳香环）
使f • 给电子基 -NH2、-OH、-OR • 吸电子基 -COOH、-NO2、 -NO 使f • 某些重原子（卤族Br或I），引起 体系间跨越 使 f
3.化学环境与荧光
（1）温度
温度升高， f ↓；温度降低， f ↑
原因：温度升高，分子间碰撞频 率增加，外转移几率增加
（4）取代基效应： •芳环上有给电子基，使荧光增强 •吸电子基，使荧光强度减弱 •重原子（Br和I）引起体系间跨越， 使荧光强度减弱。
3.影响分子荧光的外部因素
（1）温度： 温度越高，荧光效率越低，温度越低， 荧光效率越高。 （2）溶剂效应： •溶剂极性越大，分子荧光效率越高； •含重原子的溶剂导致体系间跨越，分子荧 光效率下降； •与荧光分子形成氢键的溶剂，使分子荧光 效率下降。
H N N H O
C6H5 C6H5 O
KMnO4 OH-
C6H5 C C6H5 O
苯妥英
二苯酮
2）水解反应
氨苄青霉素：pH=2的酸性溶液中，以甲醛为 催化剂，在90℃下水解成能产生荧光的化合物2,5二酮哌嗪。
H O C C NH NH2 O S CH3 CH3 COOH O H+ H2O NH HN R O
（3）pH值： 荧光物质为弱酸弱碱，酸度的改变 会导致荧光物质分子结构改变，使荧光 效率改变。 （4）荧光熄灭剂：荧光熄灭剂的存在会 引起荧光分子荧光强度减弱或消失。
If
a
b
300
400
500
/nm
硫酸喹啉的激发光谱和荧光发射光谱
S1 (V 0) S0 (V 0，2) 1， hc
f
②发射光谱与激发光谱呈镜像对称关系
a If
荧光激发光谱
b c
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
500
/nm
蒽的激发光谱和荧光发射光谱
三、荧光定量分析基本原理
（3）pH
对酸碱化合物，溶液pH影响较大：
NH3+ OHH+
NH2 OHH+
NH-
pH<2 无荧光
pH 7~12 蓝色荧光
pH>13 无荧光
α-萘酚：
OHH+ OH O-
无荧光
有荧光
（4）荧光熄灭剂
荧光熄灭：荧光物质分子与溶剂分子或其 它溶质分子相互作用，引起荧光强度下降 或消失的现象。
荧光熄灭剂：能够引起荧光强度降低或消失 的物质。
(2) 共轭效应
分子的共轭效应越强，荧光效率越高，荧 光发射波长越大。
化合物
苯
激发波长 发射波长 （λ ex/nm） （λ em/nm） 0.10 205 278 0.18
0.29
f
联二苯
萘
245
286
316
321
蒽
并四苯
0.46
0.60
365
390
400
480
(3)分子刚性共平面结构
共平面：分子结构处于一个平面上。 平面结构的分子比非平面的分 子荧光效率高
因此，在较低温度下测定荧光，有利 于提高分析的灵敏度。
（2）溶剂效应
增大溶剂极性，f 增大，荧光波长向长波长
方向移动。
含重原子的溶剂（如CBr4和C2H5I），引起
体系间跨越，物质f 减弱。
与荧光分子形成氢键的溶剂，使分子f 减弱
极性增大 溶剂 If 苯 1 乙醇 30 水 1000
喹啉在不同溶剂中的相对荧光强度
1. 荧光强度与溶液浓度的关系
Ia I0 If It
If= f·a= f · 0 －It) I (I It=I0· -A 10
If = fI0(1-10-A) = fI0(1-e-2.3A)
2 3 2.3 A 2.3 A I f = f I 0 2.3 A 2! 3!
与有机试剂形成配合物后测定（约60种元素）
测定离子 Al3+ FB4O72Li+ Sn4+ 激发波长 发射波长 ex/nm em/nm 470 500 2,2’-二羟基偶氮苯 470 500 2,2’-二羟基偶氮苯 二苯乙醇酮 8-羟基喹啉 黄酮醇 370 370 400 500 580 700 荧光试剂 检测限 μg·mL-1 0.007 0.001 0.04 2.0 0.2
i
（1）凡是使分子荧光发射几率增大的因素，
都会使分子的f ↑，If ↑ 。
（2）凡是ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ外传移（碰撞）几率增大、使分
子磷光发射（体系间跨越）几率增大的因素，
都会使分子的f ↓，If ↓ 。
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，体系间跨越 的速率常数小，有利于荧光产生。 （2）共轭效应：提高共轭程度有利于增加荧光效率 并产生红移。 （3）刚性共平面结构：增大分子共轭程度，降低分 子振动，故增加荧光效率。
i
f
由公式：k f ，
k f ki
i f
kf
k ，分子的荧光效率
。
k f 主要取决于分子结构；
k 主要取决于化学环境。
i
分子产生荧光的条件：
1.对紫外－可见光有强吸收。(分子结构) 2.分子去激发时，无辐射跃迁几率小，
辐射跃迁几率大。（化学环境）
2.分子结构与荧光
2.激发波长
绘制荧光激发光谱，选择能产生最强荧光的 激发波长（ex），即最大激发波长，作为分析的 激发波长。
3. 发射波长
绘制荧光发射光谱，选择能产生最强荧光的 发射波长（em），即最大发射波长，作为荧光测 定波长。
4.浓度线性范围 分子荧光分析仅适用于稀溶液，溶液 的浓度应低于10-6 g· -1（A＜0.05） L 荧光物质浓度较低时，荧光强度If与物 质浓度c成线性关系。 在一定条件下，绘制If ～c标准曲线确 定浓度线性范围，以减小测量误差。
OH HO N N
2,2’-二羟基偶氮苯
H C O C OH
二苯乙醇酮
OH
8-羟基喹啉
O
OH O
黄酮醇
二、有机物分析
1. 直接法
芳香族化合物大多能发荧光，可直接测定。
例：在微碱性条件下，可直接测定： 对氨基萘碘酸:c > 0.001μg·mL-1 蒽: 0~5μg·mL-1
2.间接法
刚性：分子刚性越强，荧光效率越高
H C C
H
H C C H
1，2-二苯乙烯 （顺式，非平面） 无荧光
1，2-二苯乙烯 （反式，平面） 强荧光
刚性分子：物质分子共平面大，使分
子振动减小的分子。
C H2
联二苯
芴
f = 0.2
f = 1.0
使分子共平面增大的方法：
引入某些基团、氧环形成封闭环
N
氨苄青霉素
2,5-二酮哌嗪
3）与荧光试剂反应
磺胺类药物与荧光试剂邻苯二甲醛缩合反应， 生成荧光化合物。
H2N SO2NH2 + CHO CHO
O C N C H2 SO2NH2
含氨基的药物与荧光试剂丹酰氯（DANS-Cl） 反应，生成荧光化合物。
H3C N CH3 H3C N CH3
+ RNH2 SO2Cl SO2NHR
1
2
2
3
去激发的方式：
产生荧光
产生磷光
外传移，放出热量
二、影响分子荧光的因素 1. 荧光效率f（荧光量子产率）
发射荧光的分子数 f 被激发的分子总数
或
发射光量子数 f 吸收光量子数
f还可表示如下：
f
k f ki
kf
k f 为荧光发射过程的速率常数
k 为各种无辐射跃迁过程的速率常数之和
(1)跃迁类型： π* →π和π* → n
π* π π* n
π*→π比π*→n跃迁的荧光效率高
原因：
1. π→π* 跃迁比n→π* 跃迁的εmax 大 102～103倍。 2. π*→π跃迁的寿命（10-7 ～ 10-9s）比 π*→n跃迁的寿命（10-5 ～ 10-7s）短。
3. π*→π跃迁的能量差比π*→n跃迁的 能量差大（∆Eπ*→π > ∆Eπ*→n ）。
色散元件
滤光片 — 荧光光度计
光栅 — 荧光分光光度计
荧光分光光度计
①激发单色器:置于样品池前，得到单色性好的
激发光（ex，I0）
②发射单色器:置于样品池后，从荧光光谱中分
离出某一波长的荧光（em，If）
3. 样品池
以石英为材料，四面均为透光面。
4. 检测器
①光电管——荧光光度计 ②光电倍增管——荧光分光光度计 ③二极管阵列及电荷转移检测器——高档荧光分 光光度计