愈创木酚法测定酶活性方法

愈创木酚法测定活性酶定操作

一、实验目的

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。

二、实验原理

在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收值，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。

四、设备与试剂

分光光度计，TDL-5000B型低速冷冻多管离心机(R=18cm)，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。0.05mol·L-1的磷酸缓冲液（pH5.5），0.05mol·L-1愈创木酚溶液，2％H2O2。

五、实验步骤

（一）酶液的制备

取1.0～5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000×g离心10min，上清液转入25mL容量瓶中。沉淀用5mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。

（二）过氧化物酶活性测定

酶活性测定的反应体系：依次加入 2.9mL0.05mol·L-1磷酸缓冲液；1.0mL2％H2O2；1.0mL0.05mol·L-1愈创木酚和0.1mL 酶液。用加热煮沸5min 的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于34℃水浴中保温3min，然后迅速稀释1倍，470nm 波长下比色，每隔1min记录1次吸光度A470，共记录5次，然后以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位（U）。

六、实验结果

以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）。

W——马铃薯鲜重（g）；

t——反应时间（min）；

VT——提取酶液总体积（mL）；

VS——测定时取用酶液体积（mL）。

七、注意事项

酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。H2O2要在反应开始前加，不能直接加入。