生化分离技术考试题目

第一章1.1何谓生化分离技术的集成化概念？请举例加以说明。

1) 利用已有的和新近开发的生化分离技术，将下游过程中的有关单元进行有效组合(集成);2) 或把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标；例子⑴多种分离、纯化技术相结合，包括新、老技术的相互渗透与融合，形成所谓融合技术；⑵生化分离技术（下游技术）与发酵工艺（上游技术）相结合或称耦合，形成系统工程；
1.2说明生化分离的主要步骤并指出胞内产物和胞外产物的分离纯化流程不同之处
①材料及处理来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少②目的物的提取将目的物从材料中以溶解状态释放出来，方法与存在部位及状态有关③分离纯化核心操作，须据目的物的理化性质，生物性质及具体条件定④浓缩，结晶，干燥⑤保存整个过程应有快速灵敏准确的分析方法来衡量效果（收率、纯度）（胞内外的区别就是在于破壁）
2.1简要说明常用细胞破碎的主要方法、原理、特点、适用范围及细胞破碎今后的发展方向。

①胞捣碎法，原理：机械运动产生剪切力适用于动植物组织
②高速匀浆法，破碎程度较上法好，且机械剪切力对生物大分子的破坏较小，处理量大。

原理：利用高压使细胞悬浮液通过针型阀，由于突然的减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。

适用于：较柔软、易分散的组织细胞。

③研磨法和珠磨法适用于微生物与植物细胞④挤压瓶适用于细菌（G-）
⑤超声破碎⑦物理法（反复冻融动物材料、渗透压冲击细胞壁脆弱的微生物、急冷骤热（细菌病毒等热不敏感的物质））⑧干燥法（热空气干燥法适用于酵母，真空干燥法适用于细菌，冷冻干燥法适用于不稳定的酶）⑨化学法，1、溶剂处理法丙酮、氯仿、甲苯等脂溶性溶剂可溶解胞膜上脂质化合物，使细胞结构破坏。

2、表面活性剂法添加如十二烷基磺酸钠、去氧胆酸钠等，通过破坏细胞膜而破碎细胞，释放目的物。

此法常需与其它方法结合应用⑩酶解法，1．自溶法，将欲破碎细胞在一定条件（pH、T）下保温一定时间，通过细胞本身存在的酶系的作用，将细胞破坏，使胞内物质释放。

2．外加酶法利用各种水解酶专一性地将细胞壁分解，使内含物释放出来。

细菌：加溶菌酶（结合反复冻融或加EDTA）酵母：采用β-葡聚糖酶霉菌：添加几丁质酶植物材料：加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。

发展方向：㈠多种破碎方法相结合㈡与上游过程相结合㈢与下游过程相结合(如:利用金黄色葡萄球菌,发酵生产A蛋白。

通常A蛋白结合于菌体胞壁上,需要进行细胞破碎,然后将A蛋白从胞壁上剪切下来,过程繁琐,难度大。

若用生物技术培养出A蛋白分泌型菌来生产,A蛋白的分离纯化就容易得多.)
2.2、简述盐析分级范围的选择依据？某纯酶和粗酶的盐析分级范围是否相同？为什么？
可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得P8，回收率和纯度考虑。

纯酶的分级范围比粗酶宽一些，因为纯酶的纯度比较高一些，在采用盐析时更注重回收率，可以适当加宽分级范围，而粗酶由于杂志较多则注重纯化倍数。

2.3、从植物或动物材料中提取酶类，一般预处理过程中影响酶收率的原因是什么？如何解决?
植物组织被破坏时，酶和酚类处混合接触状态，很易发生反应。

产物苯醌和单宁酸类会继续和酶蛋白反应, 使目的酶失去活性。

为此去除酚类化合物或避免反应是必须进行的步骤。

⑴温度尽可能低；⑵提取液的量要保证“充分浸入”；⑶加入足量酚类吸附剂；（天然清蛋白，合成聚丙乙烯）⑷加入足量氧化酶抑制剂；2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)及二硫赤藓糖醇(DTE)是常用的抗氧化剂，又是醌的清除剂；⑸搅拌转速要恰当；⑹ pH要控制在合适范围，一般5.5～7
2.4、分离技术的主要种类：细胞破碎(cell disruption)沉淀分离(precipitation膜过滤(membrane filtration) 层析分离(chromatography) 电泳分离(electrophoresis) 离心分离（centrifugation）1形状和大小：凝胶过滤、超滤、透析⑵电离性质离交色谱、电泳（除SDS）⑶极性（疏水性）分配、吸附、疏水色谱⑷生物功能或特殊化学
基团亲和色谱⑸等电点pI 色谱聚焦、电聚焦⑹溶解性盐析、有机溶剂提取、结晶⑺密度、大小超离心SDS-凝胶电泳
2.5怎样选择细胞破碎的方法？总原则：最大提取、不易变性、减少干扰
具体须从材料特性和目的物特性综合考虑。

1．材料细胞的特性动物细胞易破碎，只需用温和方法植物细胞较难破碎，须用中等或强度大的方法，微生物细胞较复杂，一般用较强方法2.目的物的特性⑴细胞中的位置游离状：只需温和破碎，除去不溶部分。

结合状：可能结合在膜或细胞器内需先收集膜或细胞器，再破碎⑵敏感性温度、pH、氧、剪切力、杂酶等影响⑶处理量有些处理量大，如组织捣碎机、匀浆器等。

有些处理量少，如超声波破碎等。

3.1膜分离1、何谓“浓度极化”现象，怎样避免膜过滤中的“浓度极化”现象？
浓差极化concentration polarization ：指外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，而大分子被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度的现象。

是指在超滤过程中，由于水透过膜而使膜表面的溶质浓度增加，在浓度梯度作用下，溶质与水以相反方向向本体溶液扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。

在反渗透过程中，由于水不断地透过膜，引起膜表面附近的溶液浓度升高，从而在膜的高压一侧溶液中，从膜表面到主体溶液之间形成一个浓度梯度，引起溶质从浓的部分向淡的部分扩散，这一现象即为浓差极化。

(1)增高流速首先可以采用化工上溶胀的增加骚动的措施。

也就是说设法加大流体流过膜面的线速度，其中也包括采用层流薄层流道法。

(2)填料法如将29---100UM的小球放入被处理的流体中，令其共同流经反渗透器以减小膜边界层的厚度而增大透过速度。

小球的材质可用玻璃或甲基丙烯酸甲酯制作。

此外，对管形反渗透器来说，也可向进料中微形海绵球，不过，对板式和卷式组件而言，加填料的方法是不适宜的。

主要是因有将流道堵塞的危险。

(3)装设油液促进器所谓湍流促进器一般是指可强化流态的多种障碍物，例如对管式组件而言，内部可安装螺旋挡板，对板式或卷式的膜组件可内衬网栅等物以促进湍流，实验表明，这些湍流促进器的效果很好。

(4)脉冲法主要作法是在流程中增高一脉冲发生装置，使液流在脉冲条件下通过膜分离装置，脉冲的振幅和频率不同，其效果也不一样。

对流速而言，振幅越大或频率不同，其净利要也不一样，对流速而言，振幅越大或频率越高，透过速度也越大，虽然动力增加了25---50%，但是，换来了透过速度提高了70%的得益，有相当经济价值。

(5)搅拌法是目前应用广泛，特别是在测试装置中必定使用的一种方法。

其主要作法是在膜面附近增高搅拌器，也可以和在磁力搅拌器上回转使用，试验表明，传质系数与搅拌器的转数成直线关系。

(6)加分散阻垢剂为防止反渗透膜结垢，某厂过去曾以加硫酸或盐酸调节PH值，但因酸系统的腐蚀和泄漏使操作者很感麻烦，现在改用一种PTP-0100的高效阻垢分散剂可免去加酸的麻烦，并使系统运行正常。

3.2、简述微滤膜的主要种类，特点和主要分离机理。

种类据材质分成：1）有机微滤膜，具韧性，适应性强，制备简单，易成形，工艺较成熟。

常用聚乙烯、聚偏氟乙烯和聚四氟乙烯等聚烯烃类聚合物组成。

2）无机微滤膜，无机陶瓷膜具备化学稳定性好、机械强度大、抗污染能力强、耐高温、孔径分布窄、可高压反冲洗、再生能力强、分离效率高、不易老化等优点。

3）复合微滤膜，复合微滤膜充分利用了有机与无机微滤膜的各自优点。

复合微滤膜的制备包括三种形式1）将一层微滤膜的薄膜和常规过滤介质利用层压技术复合在一起；2）通过不同的工艺手段实现有机与无机的黏合改性；3）将微滤膜技术与生物处理法相结合的新型复合式膜生物反应器(IMBR) 分离机理(1)筛分，膜将尺寸大于孔径的颗粒截留。

(2) 吸附，膜将尺寸小于孔径的颗粒吸附截留。

(3)架桥，固体颗粒在膜微孔入口处因架桥而被截留。

(4) 网络，截留发生在膜内部，因膜孔的曲折而形成。

(5) 静电，分离悬浮液带电颗粒时，可采用带相反电荷的微滤膜。

能用孔径比待分离的颗粒尺寸大许多的微滤膜，不仅可达到较好的分离效果，还可获较高通量。

3.3、膜选择和使用时考虑的主要参数是什么？影响流率的主要因素是什么？
不管微滤、超滤还是纳滤，选择时，一般应注意以下指标。

⒈截留分子量---指截流率达90%以上
的最小被截留物质的分子量。

（以球形分子测）*一般选用的膜的额定截留值应稍低于所分离或浓缩的溶质分子量。

2.流动速率--- 指在一定压力下每分钟通过单位面积膜的液体量。

(ml/cm2.min) 。

其它还有操作温度、化学耐受性、膜的吸附性能、膜的无菌处理等等。

影响流率的因素：⒈溶质的分子性质，比重大的纤维分子扩散性差，比重较小的球形分子易扩散⒉溶质浓度：一定压力下，稀比浓流率高；⒊压力：不同溶质应选择不同的操作压力；⒋搅拌：加快扩散，减少浓度极化，提高流率；*对切力敏感的大分子（酶、核酸）须控制搅拌速度; ⒌温度：升温能提高流率（不同溶质区别对待）; ⒍其它：如溶液pH、离子强度及溶剂因素等对流率均
链RNA、杂链RNA、双链DNA，为什么？DNA与羟基磷灰石的相互作用基于DNA磷酸酯骨架与羟基磷灰石中的钙离子间的作用。

洗脱时用磷酸缓冲液，核酸分子的亲和性受其分子中磷酸集团的控制。

单链rNA分子的结构可变无序，它与刚性有序的双链DNA分子相比，亲和力要小。

杂交的双链DNA及部分变性的DNA分子的亲和力适中。

因此单链DNA分子结合弱，结合的双链DNA分子可以通过增加磷酸洗脱缓冲液的浓度使之解离。

胶过滤层析5.1、名词解释1）排阻极限用A类分子中最小分子量表示Mwamin2）分级范围实际是B类分子的分子量范围 3）死体积4）外水体积(V0) 间隙液体体积5）内水体积(Vi) 孔隙体积
5.2、Kd的意义是什么？为什么它一般在0和1之间，大于1和小于0的反常情况可能是什么原因？怎样处理？K d 是分配系数=固定相溶质的浓度/流动相溶质的浓度，A类分子只走外水体积，所以K d=0 ;C类分子走所有的外水体积和内水体积Kd = Ve —V0/ Vi所以Kd大于0小于1. 溶质洗脱的异常⑴. K d〈0 因装柱不好，发生沟流（短路）⑵. K d〉1 凝胶对溶质分子可能有吸附作用
5.3、请判断分子量为1千和3千的一组分子，或分子量为8万和10万一组分子能否在Sephadex G-75柱中分开？为什么？
因为sephadeG-75的分离范围为10000到50000所以两组分子都在分离范围之外，不能很好的分离。

5.4、伴刀豆球蛋白、血纤维蛋白、香菇多糖的分子质量能否一起用葡聚糖凝胶层析柱测定？为什么？
凝胶过滤层析，是根据凝胶颗粒具三维网状结构，可对大小不同的分子流动产生不同的阻滞作用，但是以上三种大分子物质的结构不同，这就会影响其在凝胶中的分配比。

球状的蛋白要比血纤维的蛋白走的快，因此分离的最后效果，不仅和分子量大小有关，而且和分子的形状有关，所以不能直接用来测定三种的分子量大小。

可以先将他们变性，使其有相类似的结构，然后再测定。

5.5、请列出凝胶过滤层析填料主要种类，并简要说明该填料特点及应用范围。

凝胶是含有大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构。

总要求：: ⑴多孔、孔隙区大，Vi 要大⑵亲水⑶惰性。

⑷稳定⑸色谱性能好
填料有以下几种：
1.交联葡聚糖（sephadex）：骨架为葡聚糖（dextran）主键为α-1,6糖苷键（约95%）分支：α-1,3糖苷键（约5%）交联剂：环氧氯丙烷以醚键交联，特点：化学稳定性较好PH范围为2~12，在强酸下凝聚糖苷键易水解，在强碱下，羟基易氧化成酸。

热稳定性较好，可以高压灭菌。

使用范围：总的工作范围为分子量100~60万。

有一定的离子吸附性（离子性、芳香性）。

2、聚丙烯酰胺（bio-gelp-x）丙烯酰胺用N,N′ 甲叉双丙烯酰胺铰链而成，其中x为2~300，x=工作范围/1000.特点：稳定ph范围2~11，物理稳定性和sephadex相同，总工作范围为100~40万。

吸附性：I>0.02
3、交联丙烯基葡聚糖（Sephacryl）N,N′ 甲叉双丙烯酰胺交联的烯丙基右旋糖苷形成的凝胶，较硬，强度大，特点：稳定ph范围：2~11较Sephadex 抗压色谱性能作范围：1000～7亿吸附性：I 〉0.05
4、琼脂糖凝胶（Sepharose）β-D半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的线性多聚糖糖浓度越大，网孔越小型号：Sepharose 2B、4B…表示糖浓2%… Bio-Gel A 0.5～150M 表示工作范围上限特点：稳定的ph范围4.5~9.0，抗热性差，抗压性好，总工作范围：103～4×107 吸附性：需I＞0.02
5、㈠. 结构：强碱条件下用2,3—二溴丙醇或环氧氯丙烷进行交联㈡.稳定性⒈化性：pH 3～14 ⒉物性：抗热、抗压均提高㈢.色谱性能 1.工作范围：同Sepharose ⒉吸附性：下降
6、superose 一种具高分辨率，高机械强度，很宽分级范围的新型凝胶过滤介质，是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经过两次交联后得到的，适合于组分分子量差异较大的混合物的分离。

Superose具体特点：⑴. 机械和物理稳定性很好，适合于高速分离过程，即使用高粘度的洗脱剂如8mol/L尿素仍能保持较高的流速，在pH7，121℃反复高压灭菌不会对凝胶结构产生明显影响;
⑵.化学稳定性也很好，能够耐受0.2mol/L的NaOH，0.01mol/L的盐酸，1mol/L的醋酸，去污剂如1%SDS，促溶盐类，变性剂如8mol/L尿素和6mol/L盐酸胍等。

7、Superdex颗粒很小且均匀，柱效非常高，很高的流速下仍能获得非常高的分辨率；物理稳定
性良好，pH7条件下能承受高压灭菌；pH稳定性良好，清洗时（短程）可暴露在极端pH（1～14）下而不会对层析行为产生影响；凝胶的分离行为不受去污剂如1%SDS，促溶盐类，变性剂如8mol/L 尿素或6mol/L盐酸胍的影响。

该介质同样能在有机溶剂中使用。

5.6、请按凝胶层析流程顺序分析说明主要操作要点。

实验设计的总的要求：高分辨率、回收率高、减少稀释、短时间、最好保证样品为组别分离，已知目的物的Mw ：原则：选斜率大即Kd大，效果好；选排阻极限低的凝胶，可早些洗出。

未知目的物的Mw 先用中等工作范围的，再据结果进行选择。

样品的浓度＜70mg/ml ；离子强度；综合考虑种种因素：分级分离时，Vs一般选1～3% Vt；组别分离时，Vs可选30%最好15～20% Vt ；据样品量确定分级分离：Vt = 30～100 Vs 组别分离：Vt = 3～6 Vs；H/D分级分离：H/D可选择在30～100 ；组别分离：H/D 相对可低些。

H/D 小，抗流变性差，区带易发生崎变，但流速大；H/D 大，抗流变性好，区带不易发生崎变但流速小。

洗脱剂据凝胶溶质的要求来选择洗脱剂应与平衡液一致，以免体积变化；吸附较强的，调节pH和离子强度；需冷冻干燥的，选挥发性盐类；对脱盐操作，可选用蒸馏水；流速流速过大，动定相不平衡流速过小，纵向扩散增加
Gel的选择和准备1. 凝胶溶涨
一般湿胶∶洗脱剂（v/v）=3∶1的比例添加洗脱剂，搅匀后即可装柱；干胶用量（g）＝πr2h / 膨胀度（床体积mL/g干胶）⒉倾析用此法除去上部过细部分（破损凝胶）⒊稠度一般控制沉积体积为总体积70～75% ⒋脱气
仪器的准备装柱：要求：均匀、无裂缝、无气泡、床面平整一般步骤：安柱充填平衡检验**对软胶，装前须先校对操作压力！
加样：要求：不能干扰Gel沉淀表面方法：排干法、直接法、加样器法洗脱速控制
收集、检测紫外连续检测清洗一般用洗脱液继续平衡即可若被脂肪污染，可用0.1～0.5mol/LNaOH（除Sepharose）或非离子表面活性剂清洗。

贮藏须加化学试剂防腐，0.02～0.05%的叠氮钠
离子交换层析
6.1、层析系统的分辨率主要取决于什么参数，何种最重
要？
层析系统的分辨率主要取决于：选择性α，效率n，和k′
容量因子三个参数。

选择性较为重要。

容量因子k′又称保留因子，是层析分离中常用的组分保留值表示法，注意不要将其与离子交换剂的吸附容量（mg样品/ml胶）相混淆。

一般来说，容量因子k′的取值与蛋白质在固定相（离子交换剂）和流动相（缓冲液）中的分配性质、层析温度及固定相和流动相的体积比有关，而与柱尺寸和流速无关。

提高RS以达满意分离效果，须满足以下条件：
（1）α＞1（当VR1＝VR2时α＝1，两峰完全重叠，分辨率为0），α的值越大，两峰相距越远，分辨率越高；（2）N尽可能大，理论塔板数越大，柱效率越高，分辨率也越高；
（3）k′≠0，若k′＝0，无法实现分离，分辨率为0，需选合适层析条件，使至少一种蛋白质在离子交换剂上发生吸附，就能满足k ′≠0，增加k′的值将提高分辨率R S，有利于分离。

6.2、装填制备合格的层析柱主要应注意那几点？如何检验？如何保养？
㈠.柱尺寸（H/D）;连续梯度：H/D 4～5；阶段式梯度：H/D1～2；㈡. 充填；㈢. 平衡：2～3Vt始缓平衡，测定电导、pH是否平衡完毕：目的：①.床体积稳定②.流出液pH、I一致
样品；测完后清洗
6.3、离子交换剂由哪几部分组成？何为阳离子和阴离子交换剂？
离子交换剂是离子交换技术的核心和基础：基质+功能基团+平衡离子离子交换时平衡离子发生交换为阴离子，是阴离子交换剂；为阳离子，是阳离子交换剂
6.4、弱酸性和弱碱性的离子交换剂分别适宜在哪些pH范围内使用？为什么？
强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽；弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小；弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱；弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱。

流动相的酸度：离子交换树脂就是固体酸碱，对于强型而言pH影响不大，弱型则显著。

强酸型阳离子，pH>2；弱酸型阳离子，pH>6；强碱型阴离子，pH<12；弱碱型阴离子，pH<7
6.5、已知目标蛋白是分子量约200,000，等电点为6.8，pH稳定范围在4.0~
7.5的酶分子，如何选择离子交换剂并设定层析条件？10万-20万用Sepharose或交联纤维素，弱阳离子交换剂CM(pH3.5-6)，流动相的ph5,流速1cm/min
6.6、在对某样品进行离子交换层析分离后得到如下层析图谱，层析采用了NaCl浓度梯度洗脱，NaCl终浓度为1mol/L，如何根据此层析结果优化层析条件？（*号标记的是目标蛋白）
亲和层析
7.1、试比较亲和层析的特异性洗脱和非特异性洗脱的优缺点。

（1）.上样亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的方法。

亲和层析柱一般很短，通常10cm左右。

上样时应注意选择适当的条件，包括上样流速、缓冲液种类、pH、离子强度、温度等，以使待分离的物质能够充分结合在亲和吸附剂上。

一般生物大分子和配体之间达到平衡的速度很慢，所以样品液的浓度不易过高，上样时流速应比较慢，以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。

特别是当配体和待分离的生物大分子的亲和力比较小或样品浓度较高、杂质较多时，可以在上样后停止流动，让样品在层析柱中反应一段时间，或者将上样后流出液进行二次上样，以增加吸附量。

样品缓冲液的选择也是要使待分离的生物大分子与配体有较强的亲和力。

另外样品缓冲液中一般有一定的的离子强度，以减小基质、配体与样品其它组分之间的非特异性吸附。

生物分子间的亲和力是受温度影响的，通常亲和力随温度的升高而下降。

所以在上样时可以选择适当较低的温度，使待分离的物质与配体有较大的亲和力，能够充分的结合；而在后面的洗脱过程可以选择适当较高的温度，使待分离的物质与配体的亲和力下降，以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。

上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。

平衡缓冲液的流速可以快一些，但如果待分离物质与配体结合较弱，平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。

如果存在较强的非特异性吸附，可以用适当较高离子强度的平衡缓冲液进行洗涤，但应注意平衡缓冲液不应对待分离物质与配体的结合有明显影响，以免将待分离物质同时洗下。

（2）.洗脱：亲和层析的另一个重要的步骤就是要选择合适的条件使待分离物质与配体分开而被洗脱出来。

亲和层析的洗脱方法可以分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱。

（1）特异性洗脱特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。

特异性洗脱也可以分为两种：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。

前者在洗脱时，选择一种和配体亲和力较强的物质加入洗脱液，这种物质与待分离物质竞争对配体的结合，在适当的条件下，如这
种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，原来与配体结合的待分离物质被取代而脱离配体，从而被洗脱下来。

例如用凝集素作为配体分离糖蛋白时，可以用适当的单糖洗脱，单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合，可以将糖蛋白从凝集素上置换下来。

后一种方法洗脱时，选择一种与待分离物质有较强亲和力的物质加入洗脱液，这种物质与配体竞争对待分离物质的结合，在在适当的条件下，如这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大，待分离物质就会基本被这种物质结合而脱离配体，从而被洗脱下来。

例如用染料作为配体分离脱氢酶时，可以选择NAD+进行洗脱，NAD+是脱氢酶的辅酶，它与脱氢酶的亲和力要强于染料，所以脱氢酶就会与NAD+结合而从配体上脱离。

特异性洗脱方法的优点是特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。

另外对于待分离物质与配体亲和力很强的情况，使用非特异性洗脱方法需要较强烈的洗脱条件，很可能使蛋白质等生物大分子变性，有时甚至只能使待分离的生物大分子变性才能够洗脱下来，使用特异性洗脱则可以避免这种情况。

由于亲和吸附达到平衡比较慢，所以特异性洗脱往往需要较常的时间和较大的洗脱条件，可以通过适当的改变其它条件，如选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度等等，来缩小洗脱时间和洗脱体积。

（2）非特异性洗脱
非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。

当待分离物质与配体亲和力较小时，一般通过连续大体积平衡缓冲液冲洗，就可以在杂质之后将待分离物质洗脱下来，这种洗脱方式简单、条件温和，不会影响待分离物质的活性。

但洗脱体积一般比较大，得到的待分离物质浓度较低。

当待分离物质和配体结合较强时，可以通过选择适当的pH、离子强度等条件降低待分离物质与配体的亲和力，具体的条件需要在实验中摸索。

可以选择梯度洗脱方式，这样可能将亲和力不同的物质分开。

如果希望得到较高浓度的待分离物质，可以选择酸性或碱性洗脱液，或较高的离子强度一次快速洗脱，这样在较小的洗脱体积内就能将待分离物质洗脱出来。

但选择洗脱液的pH、离子强度时应注意尽量不影响待分离物质的活性，而且洗脱后应注意中和酸碱，透析去除离子，以免待分离物质丧失活性。

对于待分离物质与配体结合非常牢固时，可以使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂使蛋白质等待分离物质变性，而从配体上解离出来。

然后再通过适当的方法使待分离物质恢复活性。

7.2、亲和层析吸附剂制备时，为何常引入“手臂”？
在载体和配基间引入适当长度的“手臂”，减少载体的空间阻碍，增加配基的活动度。

连接臂往往为由烃链组成的疏水性手臂（其长短对吸附的影响大）或具氨基、羧基的亲水性手臂（其长短对吸附的影响不大）；疏水性手臂具体选择应考虑：⑴分离物质分子量大小⑵亲和势大小⑶过长手臂易弯曲、折叠等；最常用的连接臂有6-氨基己酸、1,6-己二胺和3,3’-二氨基二丙胺。

7.3、简述亲和层析吸附剂制备的主要方法和步骤。

一、要求㈠. L与基质结合，对L-S结合无干扰；㈡. L为小分子有的需“手臂”，使L-S结合更有效；㈢. 非专一吸附不大，以免吸附杂质；L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。

二、偶联用Gel的选择需考虑：㈠. L上可供偶联的基团㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH 三、由CNBr 活化型Sep.4B制备商品名：CNBr-Sepharose
㈠. 溶胀和洗涤用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子
㈡. 偶联条件注意：前处理、偶联密度、缓冲液种类及pH
㈢. 掩蔽偶联后有部分氰酸酯未偶联上L，常利用含-NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理，将其掩蔽。

㈣. 洗去未结合L 用高-低交叉pH来洗（4～5次）
7.4、亲和层析的特殊类型有哪些？简述它们的基本原理和应用范围
一、共价色谱:利用形成和破坏共价键能力的差异分离,其共价键常为二硫键—S-S—,主要用于分离分子中含巯基的Pr、多肽。

二、金属螯合色谱原理：His Cys Trp能与某些金属离子形成复合物，。