透射电镜样本的制备

准
取材 部位 准确 避免 机械 损伤
净
少带 血液 及组 织液
取材具体方法
将动物麻醉或急性处死，暴露的所需脏器。 用Βιβλιοθήκη Baidu利剪刀剪下一小块组织，放到滴有预冷固定液的 蜡片上。 将组织切成细长条，再将其切成小块（1mm3）。 将小块移至装有预冷固定液的清洁小瓶内。 若组织块带有血液而使小瓶内固定液浑浊，应更换新 鲜固定液，然后置于4℃冰箱内固定。
• 缺：渗透能力弱，不能固定核酸、糖原，有剧 毒
固定方法——戊二醛-锇酸双固定
先用2.5%戊二醛固定2h以上。 缓冲液多次清洗（pH7.4 0.2mol/L磷酸缓冲液洗三 次，15min/次）。 1%锇酸固定2h。

清洗
组织在固定后，应用清洗液洗去残留的固定液 残留的醛可与锇酸反应产物细的电子致密的还原锇。 锇酸可与乙醇作用生成沉淀。

喷雾法： 将染色液和悬液样品等量混合，用特制的 喷雾器喷到有膜的铜网上，待干后可用于电镜观察。 喷雾法的优点是雾滴较小，分布均匀，不易凝结成块。 但操作较麻烦，溶液混合时易产生沉淀，并且需要耗 费较多的样品和染色液，尤其容易造成病毒扩散，故 此法不常用。

漂浮法 ：先将带有支持膜的铜网在悬液样品的液滴 上漂浮(有支持膜的那面向下)，然后再在负染色液的 液滴上漂浮。在漂浮期间，样品和染色液被吸附在铜 网的支持膜上，漂浮时间与悬滴法相近。

市售的无水丙酮含少量水分，可加入 无水硫酸钠或硫酸铜等干燥剂吸去水分。
脱水
H2O
H2O
H2O 70% 丙酮
15min
50% 丙酮
15min
90% 丙酮
15min
100% 丙酮
20min 20min
浸透和包埋

通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂逐渐取代脱水剂， 使其渗透到组织细胞中去 以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的 固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片时的各种力的 作用，有利于超薄切片。

超薄切片制样程序
• 取材：处死实验动物后半分钟到1分钟内，最多15分钟取出1mm3的组织块
• 固定：
2-3%戊二醛固定液中 4℃，2小时或更长时间。
磷酸缓冲液漂洗
1%锇酸 磷酸缓冲液漂洗
3次，每次15min。
2h 3次，每次15min。（可4℃过夜） 15min 15min 15min 2次，每次20min
负染

简单快速 可显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶 体等样品的形态、结构、大小及表面结构的特征。 病毒


负染染色剂的条件
较强的电子散射能力以产生足够的图像反差。 熔点高，在电子束的轰击下不会升华 溶解度大，不易析出沉淀。 在电镜下不呈现可观察到的结构。 分子小，容易渗入不规则表的凹陷处 与样品不起化学反应。
稳定细胞各种结构成分，不致溶解和丢失 对细胞超微结构没有损伤，保证电镜图像的真实性
能供细胞化学测定并能增强图像反差 能保留细胞的抗原性，一定的酶活性
常用固定剂
戊 二 醛
• 优：渗透能力强，组织块可长期保存，能固 定核酸，安全。 • 缺：没有电子染色作用。
锇 酸
• 优：能与蛋白质、脂类结合形成密度，可以电 子染色
复习题
简述超薄切片制样步骤 负染

• 脱水：
50%丙酮 70%丙酮 90%丙酮 100%丙酮
• 浸透：
100%丙酮：Epon812=2:1 100%丙酮：Epon812=1:1 100%丙酮：Epon812=1:2 纯Epon812
1h; 1h 1h 2-4h 35℃过夜 45℃24h 60℃24h
• 包埋：
Epon812包埋剂 Epon812包埋剂 Epon812包埋剂
银白色
金黄色
50-70nm
70-90nm
分辨率高，反差小 分辨率低，反差好
紫色
90nm以上
电子束不易穿过
Formvar（PVF）溶于纯二氯乙烯制成0.2-0.5%的制膜液
FORMVAR膜制备
染色
组织细胞的成分主要由碳、氢、氧、氮等低原子序数 的元素组成，不能形成足够的反差。 利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使 各细胞结构对电子产生不同散射程 度以增强反差。

超薄切片机

机械推进式：通过微动螺悬及微动杠杆使标本臂向刀 刃作微小推进。 热胀冷缩式推进：利用机内金属杆在加热或冷却的微 小变化来推进。


判断切片厚度：利用切片反射的光和从切片下水面反射光 发生干涉，不同厚度切片在显微镜下呈现不同的干涉色， 干涉色与切厚度的关系是： 灰色 40-50nm
透射电镜样本的制备
超薄切片制样 负染
超薄切片

由于电子的穿透能力弱，一般的组织细胞的切片，无法在 电镜下获得清晰的图像。阻碍了电子显微镜的发展。 1957年，英国Huxley发明超薄切片机。

超薄切片制片过程
取材
固定
脱水
浸透
包埋
染色
切片
取材
快
迅速 放入 固定 液中
小
0.51mm3
冷
低温 操作

目前常用的负染液：磷钨酸，磷钨酸钾，磷钨酸钠。 磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或 磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1 mol／L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4～ 7.0或实验所需的值。
样品要求
样品要适当提纯。不要求样品悬液的纯度很高，但杂 质过多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类及各 种盐类结晶的存在会干扰染色反应和电镜的观察。 样品悬液浓度适中，太稀不易找到样品，太浓样品堆 积影响观察。
包埋剂配方
季节配比 包埋液成份
Epon812 春秋 DDSA
5mL
2.495 0.62
10mL 20mL
4.99 1.24 9.98 2.48
30mL 40mL 50mL
14.97 3.72 19.96 24.95 4.96 0.68 20.56 2.48 16.96 6.2 0.85 25.7 3.1 21.2

负染染色方法

悬滴法：悬滴法 用一根细滴吸管吸一滴样品悬液滴 在有膜的铜网上，滴样时要防止铜网被液体吸到管上 来或翻转而被污染。滴液后静置数分钟，然后用滤纸 从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色 1～2分钟用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜 网上洗1～2次，用滤纸吸去水，待干后可用于电镜 观察。
MNA
DMP-30 Epon812 DDSA MNA
1.885
0.085 2.57 0.31 2.12
3.77
0.17 5.14 0.62 4.24
7.54
0.34 10.28 1.24 8.48
11.31
0.51 15.42 1.86 12.72
15.08 18.85
夏
DMP-30
Epon812 冬 DDSA MNA DMP-30
丙酮：包埋剂 2：1
丙酮：包埋剂 1：1 纯包埋剂 包埋

37℃1h
37℃1h 37℃1h 37℃过夜，45℃24h，65℃24h
理想包埋剂
聚合前的单体呈低粘度液体，能较快渗入组织
能经受电子轰炸，高温下不易升华和变形 透明度好，高倍放大不显示结构，不产生背景反差
聚合均匀充分，聚合前后体积变化小，组织无变形，微细结构保存良好

染色剂
酸酸铀 • 核酸、核蛋白、结缔 组织纤维成分 • 糖原、分泌颗粒、溶 酶体 • 对膜结构染色效果差
30min左右
柠檬酸铅 • 提高细胞膜系统及脂 类的反差 • 对细胞超微结构具有 广泛的新和力。
与CO2接触会形成不溶性碳 酸铅沉淀 10min左右
半薄切片制作
可进行定位，克服超薄切片盲目性，提高电镜观察的 效果。 修块时，将切片修得大一些，切成1μm的厚片，甲苯 胺蓝染色观察。
软硬度适中并易于调整

Epon812：环氧树脂包埋剂。淡黄色液体，黏度较 低，易渗入组织，对细胞结构保存好，在配制时需充 分搅拌。聚合后成为具有稳定三维空间结构的固体。
Epon812 DDSA（十二烷基琥珀酸酐） MNA （甲基内次甲基邻苯二甲酸酐） DMP-30（2,4,6三，二甲氨基甲基苯酚） 固化剂：控制软度 固化剂：控制硬度 加速剂

灌注固定
通过血液循环的途径将醛类固定液灌流到所要男友定 的组织中，待组织适度硬化后，切取所需组织。此法 固定迅速而均匀，可同时保存酶的活性和组织超微结 构。 适用于取材柔软组织或难以浸透、死后变化快的组织 和器官，如对中枢神经系统、视网膜和肾脏等组织的 固定。

理想固定剂
能迅速均匀的渗透到组织结构内

清洗液采用与固定液同系列的缓冲液。（磷酸缓冲液， 二甲砷酸钠缓冲液）
脱水
去除样品中的水，为包埋剂的均匀浸透做准备
含水样品在电镜高真空状态下观察反差极低
常用包埋介质与水不互溶，将细胞内的游离水分 除去后，包埋介质才能均匀地渗透到组织内部
常用脱水剂

乙醇，与环氧树脂的互溶性差，需用环氧丙烷作为 中间溶剂进行转换。 丙酮
• 超薄切片：包埋块修整成四边光滑尖端呈梯形面的锥体，切成50-70nm的超薄切片。 • 切片染色：
5%醋酸铀 双蒸水洗 柠檬酸铅染色 双蒸水洗 30min-1h。 3次 5-10min 3次
负染

阴性染色，是相对于普通染色（称正染色）而言。首 先由hall在1955年提出。 Hall在病毒研究中用磷钨 酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶 的"空洞"被清楚地显示出来。在超薄切片的染色中， 染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈 现黑色。而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为 正染色。而负染色则相反，由于染液中某些电子密度 高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品， 结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。 两者之间的反差正好相反，故称为负染色
0.085
2.425 0.925 1.65 0.085
0.17
4.85 1.85 3.3 0.17
0.34
9.7 3.7 6.6 0.34
0.51
14.55 5.55 9.9 0.51
0.68
19.4 7.4 13.2 0.68
0.85
24.25 9.25 16.5 0.85
包埋板
切片
修块 切片

固定

目的：尽可能完整保存细胞在活体状态时的超微结构 细节，避免自身酶的分解而出现自溶，或因外界微生 物的侵入繁殖而产生腐败，致使细胞的超微结构遭受 破坏。同时使细胞内的各种成分固定下来，避免在以 后的冲洗和脱水时溶解和流失。
固定方法

化学固定：浸泡固定，原位固定，灌注固定
物理固定：冷冻固定，微波固定，临界点干燥固定