SDSPAGE电泳试剂配制

SDS-PAGE电泳试剂

1) 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C；

2) 1.5M Tris-HCl(pH ：Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至,定容至100mL；

3) 1M Tris-HCl(pH ：Tris 12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至,定容至100 mL；

4) 4′分离胶缓冲液：溶于1.5M Tris-HCl(pH ，定容至100mL；

5) 4′浓缩胶缓冲液：溶于1M Tris-HCl(pH ，定容至100mL；

6) 10′电泳缓冲液(pH ：Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH2O溶解,定容至100mL；

7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH2O至10mL；

8) 2′SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH ，b-巯基乙醇，SDS 0.6g，甘油 mL，%溴酚兰 mL，ddH2O ；

9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 225mL；

10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成；

11) 分离胶%): ddH2O 4mL，30%储备胶5 mL， 4′分离胶缓冲液3mL, 10% Aps (现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL；

12) 浓缩胶（5％）：ddH2O ，30%储备胶，4′浓缩胶缓冲液， 10%Aps 50μL，TEMED 5μL。

Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳

1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备

1）正极缓冲液(10 ×)：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1. 0M HCl 调至pH8. 9 ,定容至500mL。

2）负极缓冲液(10 ×)：将60. 55g Tris ,89. 58g Tricine 及5g SDS 溶于400ml 重蒸水中,加水至终体积为500mL。

3）凝胶缓冲液(3 ×)：将181. 5g Tris ,1. 5g SDS 溶于400mL 重蒸水中,用1M HCl

滴定至pH8. 45 ,再加水稀释至500mL。

2 丙烯酰胺储存液配制

1） 3C-丙烯酰胺储存液(3C-stock)

将48g 丙烯酰胺和1. 5g 甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中配成100mL 49. 5 %的储存液。

2） 5C-丙烯酰胺储存液(5C-stock)

用重蒸水溶解47g 丙烯酰胺和2. 5g 甲叉双丙烯酰胺成100mL 49. 5 %的储存液。

3 Tricine-SDS-PA GE 的凝胶制作

1）小孔胶3mL : 1mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 4 g 甘油、1mL“6 C 凝胶储存液”、用去离子水稀释至3 mL , 临用时加入10 ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED。

2）夹层胶3 mL: 1 mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 61 mL“3C凝胶储存液”, 用去离子水稀释至3 mL , 临用时加入10ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED。

3）浓缩胶2 mL : 0. 5 mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 16 mL“3C 凝胶储存液”, 用去离子水稀释至2 mL , 临用时加入10 ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED。

用垂直小电泳槽制胶电泳。先铺小孔胶, 接着均匀注入夹层胶, 凝胶聚合后再铺浓缩胶。

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)分析

1）准备：

电泳玻璃板用双蒸水洗净，戴上手套再用无水乙醇擦拭玻璃板、梳子等并晾干，按说明安装好电泳装置。

2）%分离胶灌制

取一洁净的20mL烧杯，分别加入：

ddH2O 4mL

30%储备胶 5mL

4′分离胶缓冲液 3mL

10% Aps(现配)

100%TEMED

轻轻旋转混匀溶液，用5mL移液器灌入玻璃板间，以水封顶，使液面平整。

3）5％浓缩胶灌制

取一洁净的20mL烧杯，分别加入：

ddH2O

30%储备胶

4′浓缩胶缓冲液

10% Aps 50 μL

100%TEMED 5 μL

待分离胶凝聚后，再配制5%的积层胶，将分离胶上的水倒去，灌入积层胶，立即将梳子插入玻璃板间，待积层胶聚合后，拔出梳子，用蒸馏水洗尽凝胶顶部。

4）上样与电泳

将凝胶玻板置于电泳槽中，加入事先准备好的电泳缓冲液，加样完毕后，使样品端与阴极连通，另一端与阳极相连，根据本试验蛋白质大小等各项特性，分离胶选用120V固定直流电压，积层胶选用60V固定直流电压，当样品中溴芬兰色带快接近凝胶顶部时结束电泳，约3小时。

5）染色及脱色

电泳结束后，用考马斯亮蓝染液浸泡，放摇床上室温缓慢旋转2小时，回收染液，用脱色液浸泡凝胶，放摇床上室温缓慢摇动脱色，每两小时换一次脱色液，直至脱色完全后用数码像机拍照保存。