以人血清为培养基的大鼠全胚胎培养方法研究

以人血清为培养基的大鼠全胚胎培养方法研究

王秋枫1,赵树芬2,张秀池2,严虹英1

(11包头医学院第二附属医院内科,内蒙古包头　014030;

21北京医科大学公共卫生学院劳动卫生教研室,北京　100083)

[摘要]目的:该方法可否作为一种检测药物胚胎发育毒性效应的手段;方法:取孕

915d(头褶中期)的大鼠胚胎,分别在大鼠血清培养基和人血清培养基(90%的人血清,

10%的大鼠血清,并补充葡萄糖到3mgΠml血清)中培养48h,K lug等人的评分系

统对胚胎生长参数和形态进行评分;结果:915d的大鼠胚胎在人血清培养基中培养

48h,全部胚胎均发育正常,与在大鼠血清培养基中培养48h的胚胎生长发育情况相近;

除胚胎DNA含量以外,其他各项评价胚胎生长发育的指标与在纯大鼠血清中培养的

胚胎比较均无显著性差异(P<0105);结论:在我们的实验条件下,以人血清为培养基

培养大鼠胚胎的方法可用于胚胎早期生长发育的研究和评价。

[关键词]人血清;胚胎;发育;全胚胎培养

[中图分类号]Q95414-33,Q492-33[文献标识码]A[论文编号]100420951(2000)022*******

The use of human serum for studying growth and development of

9.5day rat embryos in whole embryo cultures

WAN G Qiu2feng1,ZHAO Shu2fen2,ZHAN G Xiu2chi2,YAN Hong2ying1

(11Department of Internal Medicine,the2nd A f f ilated Hospital

of Baoto Medical U niversity,Inner Mongolia,Baoto014030China;

21Department of Occupational Health,Beijing medical U niversity,Beijing100083China) [Abstract]Objective:To study the growth and development of9.5day rat embryos in whole embryo cultures,and if also may be used as a methed for testing the effects of exposure to drugs on embryos development;Methods:Growth of head fold stage(9.5day)rat embryos cultured for48 hours in human serum by supplemented with glucose(3mgΠml serum),and10%rat serum.The comparison of the embryo development in rat serum,and evaluated48hours later for alterations in growth and specific moropholagical parameters,using a modifiod K lug scoring system;Results:The embryos growth and development in human serum is as good as that in rat serum,there are not growth retardation or abnormal development,except DNA contents of embryos cultured with rat se2 rum,there were no statistically significant differences between data the two groups;Conclusion:The head-fold-stage(9.5day)rat embryos cultured in human serum may be used for assessment of growth and development of embryos,it also may be used as a methed for testing the effects of expo2 sure to drugs on embryos development.

[K ey w ords]Human serum;Embryos;Development;whole embryo cultures

[收稿日期]1998212214　[修订日期]2000201210

[作者简介]王秋枫(1963-),男,内蒙古包头人。内蒙古包头医学院第二附属医院内科副主任医师,医学硕士。

主要从事内科医疗,药物毒理及其预防的研究。

以人血清为培养基的大鼠全胚胎培养方法是国外近年来发展起来的新的实验方法,已用于检测疾病、药物、化学物质、营养等因素的发育毒性的研究,并逐渐开始探索应用该方法预测人体接触某些化学毒物后的潜在发育毒性,但在国内尚未见到相关的报道。

1　材料与方法

动物:Wister种大鼠,雌鼠体重在250～350g,雄鼠体重在300～400g。均由北京医科大学实验动物部提供。动物交配:取未孕的雌性及雄性大鼠在下午6:00点1:1合笼,第2d晨检查阴栓,以发现阴栓之日的中午12:00点定为妊娠015d。

试剂:Hank’s平衡盐溶液;牛血清白蛋白;Folin &Ciocalteuis Phenal试剂;小牛胸腺DNA;二苯并咪唑(H33258);4%Na

2

CO3溶液;012N NaOH溶液;1% CuSO4・5H2O溶液;2%酒石酸钾钠溶液;磷酸缓冲

液:0105M Na

2

HPO4,210M NaCl,p H=7.4;012M EDTA;血糖标准液;葡萄糖氧化酶单一试剂;链霉素和青霉素钠盐。

实验仪器:隔水式电热恒温胚养箱;实体解剖显微镜-Olympus;超净工作台;旋转培养器;转速20Πmin;72-G型分光光度计;CPS-1A超声波粉碎机;M-850型荧光分光度计;PQ-01型配气装置;离心机。

培养基,大鼠血清培养基的制备:大鼠经2%的戊巴比妥钠麻醉后,用75%的乙醇在腹部皮肤常规消毒,剖腹经腹主动脉取血,即刻离心(3000转Πmin)30min,吸取血清,56℃灭活30min,-20℃储存备用。人血清培养基的制作:选取健康无毒物接触史的成年男、女性30名(男15名,女15名,年龄20～40岁)。取清晨肘静脉血10ml,即刻离心(3000转Πmin)30min,吸取血清移入培养瓶中, 56℃30min灭活(用滤器过滤),配成90%的人血清+10%的大鼠血清,56℃灭活30min,加青霉素钠010006mgΠml,链霉素0166mgΠml,-20℃储存备用。每个血样均测葡萄糖含量,于培养前将培养基葡萄糖含量补充到3mgΠml。

胚胎的分离与培养[1]:取孕915d的大鼠经2%的戊巴比妥钠麻醉后,用75%的乙醇在腹部皮肤常规消毒,剖腹,取出两侧子宫角,移入装有Hank’s液的无菌平皿内,打开子宫角,在实体解剖显微镜下顺次剥去每只胚胎外边包绕的蜕膜,打开Reichert’s膜,壁层卵黄囊,将胚胎连同卵黄囊脏层、羊膜、外胎盘圆锥一起移置到装有培养基的培养瓶中,每瓶3只胚胎,培养瓶放于旋转培养器上,于37℃转动培养48h。

培养瓶充气[1]:放入胚胎前以及培养12h时,向培养瓶内充入5%O

2

、5%CO

2

、90%N

2

;在24h充入20%O2、5%CO2、75N2;在36h充入40%O2、5%CO2、55%N2。

培养结果的观察和评价[2,3]:依据K lug等人制定的形态学计分方法,并结合Brow和Fabro的胚胎形态学评价方法,对卵黄囊血循环、胚胎的形状、鳃弓、神经管、头、眼、耳、心、前肢芽、尾等形态发育指标逐项进行评价,同时测定卵黄囊直径、颅臀长、头长及胚胎蛋白和DNA的含量,胚胎蛋白质测定用Lowory氏法[4]。数据以( x±s)表示。

资料统计分析方法:用两均数比较的t检验。

2　研究结果

211　大鼠胚胎在人血清培养基中生长发育与在纯大鼠血清中生长发育的比较

915d的大鼠胚胎分别在人血清培养基中和大鼠血清培养基中培养48h后,胚胎形态发育正常,体节及鳃弓发育、胚胎大小及各项形态发育指标极为接近,仅胚胎DNA含量低于纯大鼠血清培养的胚胎,其余各项生长参数及形态学计分均无差异(P>0105)。见表1、2。

表1　915d的大鼠胚胎在人血清培养基与在大鼠血清中培养48h

生长参数计分和蛋白质测定值

组　别胚胎数CY(mm)CR(mm)HD(mm)SOM BRB

PRO T

(μgΠembryo)

DNA

(μgΠembryo)

大鼠血清315187±01414121±01451185±011426110±11143100±010*******±6611322188±5172　人血清935198±01534109±01461190±011926111±11292191±0128282127±5312920130±31213 注:CY-胚胎卵黄囊直径;CR-胚胎顶臀长度;HD-胚胎头长;SOM-胚胎体节数目;PRO T-胚胎蛋白质含量;DNA-胚胎DNA含量;3人血清组与大鼠血清组比较:P<0105;BRB:胚胎出现的腮弓数目。