放射免疫分析
放射免疫分析
剂量反应曲线
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放射免疫分析原理示意图
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三、放射免疫测定的优点
1）灵敏度高 大分子，ng/ml水平；小分子，pg/ml水 平。
2）特异性好 3）精确地定量 4）操作方法越来越简便 5）抗体的来源日益广泛，放射免疫可测定的微量物
质越来越多。
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第二节 放射免疫基本试剂
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一、标准品
标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准 品的量用来表示被测物质的量，标准抗原的基本要求： (1)标准抗原与待测抗原的免疫性必须一致，即它们与
以在测定中得到的相应放射性强度为纵坐标作图。 放射性强度可任选B或F，亦可用计算值B/(B＋F)、 B/F和B/B0 （零标准管结合） 。标本应作双份测定， 取其平均值，在制作的标准曲线图上查出相应的受 检抗原浓度。
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第四节 放射免疫的质控
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一、质量控制的目的
控制系统误差，减少偶然误差。 系统误差：1、试剂盒的质量；
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五、缓冲液
目前最常用的缓冲液有下列几种：①磷酸盐缓 冲液；②醋酸盐缓冲液；③Tris –HCl缓冲液；⑤硼 酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。 ①保护蛋白 ②防腐剂 ③酶抑制剂 ④阻断剂 ⑤载体蛋白
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六、试剂盒要注意的问题
1）检查药盒的数量与药盒说明书是否一致（一般 药盒内装有标记抗原、抗体、标准品、分离剂）。
特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。
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二、基本原理
1、标记抗原（Ag*） 、非标记抗原（Ag）和特异性抗体 （Ab）三者同时存在于一个反应体系，标记抗原和非标 记抗原对特异性抗体具有相同的结合力，两者相互竞争 结合特异性抗体。
Ag* + Ab = Ag* Ab +
放射免疫分析RIA
基 ➢ 抗原（antigen,Ag)：是一类能刺激机体
本
免疫系统发生免疫应答，并能与相应免疫 应答产物（抗体和致敏淋巴细胞)在体内外
定
发生特异性结合的物质。 ➢ 抗原的两种特性：免疫原性和抗原性
义
➢ 免疫原性（immunogenicity),能刺激机 体发生免疫应答，产生抗体和致敏淋巴细
胞的能力。
➢ 抗原性（antigenicity),能与相应抗体或致 敏淋巴细胞发生特异性结合的能力。
RIA基本原
理
最具代表性的一类检测技术，是建立在抗原抗体结 合的高度特异性和放射性测量的高度灵敏性的基础 上的。
Ag ＋ Ab AgAb ＋ *Ag *AgAb
动态平衡体系中，*Ag与Ag具有同样的免疫活性和结 合反应能力，当*Ag和Ab的量恒定，且Ag+ *Ag的 分子数〉抗体的分子数 ，*Ag与Ag相互竞争同Ab 结合，彼此抑制，待测Ag与*AgAb呈负相关函数关 系。
IRMA基本原 理
Ag ＋*Ab
Ag*Ab
与RIA的不同：放射性标记的是抗体 而不是抗原,且抗原与过量的标记抗体 结合反应,故反应是非竞争性的全量反 应。
IRMA与RIA的工作原理的主要区别
项目 反应机制
RIA 竞争性反应
主要反应试剂 三种 标记抗原
分离方法
抗原只需一个抗 原决定簇
待测抗原复合 与待测抗原呈负
分辨等非放射性标记免疫分析自动化技术先 后问世，检测灵敏度提高到了10–15g。
概 述
2.类型：（据特异性结合试剂的不同分类）
放射免疫分析（RIA） 1959 竞争性蛋白结合分析（CPBA） 1963 免疫放射分析（IRMA） 1968 放射受体分析（RRA ） 70年代 放射酶学分析 70年代 放射微生物分析
免疫放射分析基本原理
免疫放射分析基本原理
免疫放射分析（Radioimmunoassay，简称RIA）是一种常用的生物化学分析方法，通过使用放射性同位素标记的抗体来测量样品中特定物质的含量。
其基本原理如下：
1. 准备试样：需要测量的物质（抗原）存在于待测样品中。
样品可以是血清、尿液、分离得到的纯化物质等。
2. 标记抗体：选择能与待测物质结合的特异性抗体，并将该抗体与放射性同位素标记结合。
常用的同位素标记有^125I和
^3H。
放射性同位素标记的抗体是利用放射性同位素的射线释放特性来进行测量的关键。
3. 反应体系：将标记抗体和待测样品中的抗原加入到一个反应管中，使抗体与抗原发生特异性结合。
这一步骤通常需要一定的时间（通常为数小时）来达到最大的结合效率。
4. 分离无结合物质：通过加入剩余的非标记抗体或其他方法，分离无结合的标记抗体和未结合的物质（无结合物质）。
这一步骤可用于增加测量的灵敏度。
5. 分离被结合的标记抗体：将反应体系分离，常见的方法是利用沉淀或吸附等技术，将被结合的标记抗体与其他成分分离开来。
6. 测量放射活性：通过放射计或闪烁计数仪等设备，测量分离得到的被结合的标记抗体的放射活性。
放射活性与待测物质的
浓度呈正相关关系。
7. 构建标准曲线：使用已知浓度的标准物质重复上述步骤，测量其放射活性，并作为标准曲线的数据点。
通过与标准曲线的比较，可以确定待测样品中物质的浓度。
总之，免疫放射分析是一种利用放射性同位素标记的抗体来测量待测样品中特定物质含量的分析方法。
通过与已知浓度的标准物质进行比较，可以准确地测量待测物质的浓度。
《放射免疫分析》课件
放射免疫分析是一种广泛应用于医学与生物领域的实验技术，结合放射性同 位素和免疫反应，用于检测和定量测量生物样本中的特定分子。
简介
1 什么是“放射免疫分析”
放射免疫分析是一种使用放射性同位素标记的抗体或分子探针进行定量测量的实验技术。
2 有哪些应用场景
放射免疫分析广泛应用于临床诊断、生物学研究和药物开发等领域，特别是在肿瘤标志 物检测、激素水平测量和免疫检测方面。
3 放射免疫分析的过程
放射免疫分析包括样本 前处理、标记试剂制备、 样品配制、反应体系建 立和实验操作步骤等多 个步骤。
实验流程
1
样本前处理
对样本进行处理，使其符合放射免疫
标记试剂制备
2
分析的要求，例如去除干扰物质、浓 缩或稀释样品。
将放射性同位素与特定抗体或分子标
记在一起，以便在免疫反应中检测和
发展趋势
未来，放射免疫分析可能朝 着更高灵敏度、更低辐射和 更简化实验操作的方向发展， 也有望应用于新领域，如点of-care测试和分子影像学。
结论
结合实验结果，总结放 射免疫分析的特点和应 用，并对未来发展进行 展望。
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定量目标分子。
3
样品配制
将待测样品与标记试剂进行适当的混
合与反应，使目标分子与标记试剂发
反应体系建立
4
生特异性的结合。
为免疫反应提供适宜的环境，调整pH
值、温度和离子浓度等参数，以促进
免疫反应的进行。
5
实验操作步骤
按照合适的实验步骤和时间要求，进 行免疫反应、洗涤、分离等操作，以 获得准确的测量结果。
放射免疫分析
二、 (一)标讥抗原和抗体用量最佳化设计。 1、标记抗原用量选择。 2、抗血清的使用滴度选择及其方法。 (二) 1、 2、标准曲线工作范围 (三) (四)
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(五) 1 、反应容积 缩小反应容积可相应减少 抗体和标记抗原的绝对用量，使非标记 抗原的竞争力相应增强，有利抗原、抗体结合反 应的平衡结合常数K与温度有关必须通过 实验来确定最佳工作条件。 (六)B与F (七)
7
(四)掌握标准曲线的斜率对测定的影响 标 准曲线的斜率对放射免疫分析方法的灵 敏度和精密度均有影响。
1、亲和常数K 2、 3、 ( 五 ) 掌握 Bo( 总结合 ) 、 T( 总管 ) 、 NSB 的概
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第二节 放射免疫分析方法学 一、掌握建立放射免疫分析方法的必备条件 (一) (1)标准抗朱与待测抗原的免疫性必须一致， 即它们与抗体的亲和力和特异性应相同。 标准抗原与待测抗原所处的介质条件应基 本相同。 (2)抗原必须纯度度。 (3)标准抗原的量必须准确。 (4)标准抗原应有很好的稳定性。
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2、 (1) 双抗法 (Ab2 法 ) ：应用抗 IgG 的第二抗体 来分离B和F的方法称为双抗体法。 双抗体法具有特异、高效、非特异性结合 低、重复性好等优点。在使用此法时，往 往加入适量的第一抗体同种动物血清作载 体。同时第二抗体必须是过量(但也不宜过 大)，且以不影响反应平衡为宜. (2) 固相分离法：将特性抗体 ( 第一或第二 抗体)或抗原结合在固相物质。 (3)金黄色葡萄球菌A蛋白分离法。
第四章
放射免疫分析
目的与要求： 掌握放射免疫分析的基本原理， 实验室配置及质量控制。 内容： 放射免疫分析 (RIA) 是由 Yalow 和Berson于 1960年创建的一种体 外放射分析技术。这是检验专业 学生必须掌握和重点。
放射免疫分析临床应用刘冬
放射免疫分析临床应用刘冬放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）是一种以放射性示踪剂和免疫反应结合技术来测定生物标志物的一种方法。
该技术已广泛应用于临床医学中用于检测和测量患者体内的一些特定物质含量，如激素、抗体、肿瘤标志物等。
本文将重点介绍放射免疫分析在临床应用中的一些例子。
一、激素测定激素是机体内起调控作用的重要化学物质。
通过测定患者体内激素的水平，可以评估一些疾病的发生和发展，以及患者对治疗的反应。
常见的激素测定项目包括甲状腺激素、生长激素、性激素等。
放射免疫分析可以通过测定血液或尿液中激素的浓度，来帮助医生进行确诊和治疗方案的制定。
例如，对于甲状腺功能亢进患者，可以通过测定血液中的甲状腺素水平来确定是否需要进行手术或药物治疗。
二、肿瘤标志物测定肿瘤标志物是一种可以在肿瘤患者体内检测到的特殊物质。
通过测定血液中的肿瘤标志物的水平，可以帮助医生进行肿瘤的筛查、诊断和监测治疗效果。
放射免疫分析可以对常见的肿瘤标志物，如癌胚抗原（CEA）、前列腺特异性抗原（PSA）等进行快速、准确的检测。
例如，在临床上，对于可能患有肺癌的患者，测定血液中的CEA水平可以帮助医生进行早期诊断和有效治疗。
三、感染性疾病诊断感染性疾病的早期诊断对于患者的治疗和康复至关重要。
通过测定患者体液中的抗体水平，可以判断患者是否被特定的病原体感染。
放射免疫分析可以用来检测和诊断一些常见的感染性疾病，如乙肝、艾滋病等。
例如，对于可能患有乙型肝炎的患者，可以通过测定血液中的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和乙肝病毒表面抗体（HBsAb）来判断患者的感染状态和治疗效果。
综上所述，放射免疫分析技术在医学临床应用中发挥着重要的作用。
通过对患者体内特定物质含量的测定，可以帮助医生进行疾病的早期诊断、有效治疗和预后评估。
随着医学技术的不断发展，放射免疫分析技术在临床应用中的前景将会更加广阔。
放射免疫分析名词解释
放射免疫分析名词解释放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）是一种用于检测和定量分析生物样品中特定抗原或抗体浓度的方法。
它是将放射性同位素标记于抗原或抗体上，在放射性同位素发出的放射线与样品中的抗原或抗体发生特异性结合后进行测定，从而得出相应物质的浓度。
放射免疫分析的基本原理是免疫反应，即抗原与抗体之间的特异性结合。
在RIA中，通常选择具有放射性的同位素标记物作为追踪试剂。
标记物可以是同位素标记的抗原或抗体，其中最常用的是放射性同位素碘-125（^125I）或碘-131（^131I）。
这些放射性同位素会发出特定能量的射线，可以通过辐射探测器测量。
RIA的步骤包括样品预处理、标记物制备、抗体反应和分离、洗涤、放射测定等。
首先，需要将待测物标记为放射性同位素，常见的方法是用碘-125标记。
然后，将标记物与样品中的抗原或抗体进行相互反应，形成抗原-抗体复合物。
接着，通过分离和洗涤步骤，去除未结合的放射性同位素。
最后，使用辐射探测器测量放射性同位素发出的射线，由此可以得到样品中特定抗原或抗体的浓度。
放射免疫分析的优势在于其高灵敏度和高特异性，可以检测到极低浓度的物质。
它广泛应用于医学、生物学、生物化学等领域，用于检测和量化各种生物分子，如荷尔蒙、抗体、蛋白质、癌标志物等。
RIA还可以用于研究免疫反应、疾病诊断、药物筛选和治疗监测等方面。
然而，放射免疫分析也存在一些问题。
首先，使用放射性同位素会造成辐射危害，对实验操作人员和环境有一定风险。
其次，放射性同位素的半衰期较短，需要定期更换，增加了实验的复杂性和成本。
此外，由于放射性同位素的使用受到严格的监管和限制，一些实验室可能无法获得所需的放射性同位素。
总体而言，放射免疫分析是一种广泛应用的生物分析技术，具有高灵敏度和高特异性。
随着科技的进步，更多无放射同位素的免疫分析方法被开发出来，如酶免疫分析、荧光免疫分析等，逐渐取代了放射免疫分析的应用。
放射免疫分析的原理
放射免疫分析的原理放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）是一种利用放射性同位素标记抗原或抗体来检测物质浓度的技术。
该技术广泛应用于临床诊断、生物化学研究以及药物筛选等领域，具有高灵敏度和高特异性的特点。
放射免疫分析的原理是基于抗原与抗体之间的特异性结合。
抗原是一种能够诱导免疫系统产生抗体的物质，而抗体是一种能够特异性结合抗原的免疫蛋白。
在放射免疫分析中，通常选择特异性结合抗原的抗体，并利用放射性同位素标记抗原或抗体，以便测定样品中抗原或抗体的浓度。
放射免疫分析的步骤一般包括抗原标记、抗体固定、分离和计数等几个关键步骤。
首先，将抗原标记上放射性同位素，通常使用的同位素有碘-125（125I）、碘-131（131I）、氘-3（3H）等。
标记后的放射性抗原具有相对稳定的放射性，可用于测定抗原的浓度。
然后，将已标记的抗原与待测样品中的抗原进行特异性结合，并通过添加抗体来固定放射标记的抗原。
接着，利用分离技术（如沉淀法、凝胶层析法等）将游离的抗体或抗原分离出来。
最后，通过放射计数器测定标记抗原或抗体的放射性强度，从而计算出待测样品中抗原或抗体的浓度。
放射免疫分析的原理基于放射性同位素的高灵敏度和稳定性，使得其具有极高的检测灵敏度和特异性。
相对于传统的免疫分析方法，如酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等，放射免疫分析能够在极低的抗原浓度下进行检测，且能够检测复杂样品中的微量物质。
因此，放射免疫分析广泛用于检测激素、生物分子、药物和疾病标志物等各种生物样品中的微量物质。
然而，放射免疫分析也存在一些局限性，主要是由于放射性同位素的使用带来的放射性污染和辐射风险。
为了克服这一局限性，人们提出了许多新的代替技术，如免疫荧光分析（immunofluorescence assay，IFA）、化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）等。
分析放射免疫常用的方法
分析放射免疫常用的方法
放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)应用竞争性结合的原理，
应作放射性同素标记抗原(或抗体)与相应抗体(或抗原)结合，通过测
定抗原抗体结合物的放射活性判断结果，本方法可进行超微量分析，
敏感性高，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。
本法常用的同
位素有125Ⅰ和131Ⅰ。
放射免疫分析常用的有液相法和固相法两种：
(1)液相法：将待检标本(例如含胰岛素抗原)与定时的同位素标记
的胰岛素(抗原)和定时的抗胰岛素抗体混合，经一定作用时间后，分
离收集抗原抗体复合物及游离的抗原，测定这两部分的放射活性，计
算结合率。
在反应系统中，待检标本的胰岛素抗原与同位素标记的胰
岛素竞争夺战性与胰岛素抗体结合。
非标记的抗原越多，标记抗原与
抗体形成的复合物越少。
非标记抗原含量与标记抗原抗体复合物的量
呈一定的函数关系。
预先用标准的非标记抗原作成标准曲线后，即可
查出待检标本中胰岛素的含量
(2)固相法：将抗原或抗体吸附到固相载体表面，然后加待检标本，最后加标记抗体。
测定固相载体的放射活性，常用的固相载体有溴化
氰(CNBr)海豹化的纸片或聚苯乙烯小管。
放射免疫分析法应用范围广泛，包括多种激素(胰岛素、生长激素、甲状腺素等)维生素、药物、IgE等。
第七章-放射免疫分析技术和免疫放射分析技术(1)
(B/F)2+B/F(kAgt -kAbt +1)- kAbt =0
• 标准曲线：标准曲线可由B/F对Agt作图， 即为在放免分析中常用的标准曲线。
• 通过未知样品的B/F值，便可从曲线上读出 对应x轴上抗原浓度。
• 现工作中常用B/B0来表示，然后通过数学 模式来进行数据处理，可直接打印出求知 样品的测值。
• 1、灵敏度
• 所谓灵敏度，一般用最小检出量来表示， 但也有用零剂量的精密度来表示的。实际 上无论用哪种方法表示，某种物质的RIA， 总得表示出最小检测量，才能达到临床应 用的要求。
• 在RIA中，标准曲线的斜率反映其灵敏度， 即刚好能与被测物浓度为零时区分开来的 量。而斜率与亲和常数K成正比。
• 灵敏度的大小与K值有关，K值越大，灵敏 度超高。
• （二）标记抗体浓度对剂量反应曲线的影响
• 从图1－21可知，亲和常数Ka相同的抗体，抗体 含量越大，曲线欲达到饱和时需要更多的抗原， 这说明曲线的可测范围越宽。但应指出，由于标 记抗体量的增加，游离标记抗体也会增多，分离 时将有明显的分离误差，使NSB升高，因此测量 的灵敏度将下降，所以抗体最佳浓度应通过实验 来选择。
• IRMA的测量反应曲线是根据下式来作图：
[AgAb*]2 [AgAb*](Ag Ab* 1)[Ag][ Ab*] 0 k
[AgAb*] B
[Ag] p
[Ab*] q
代入上式
B2 B( p q 1 ) pq 0 k
• 式中，k和q是固定值，B随p增多而增大，二者呈 双曲线关系，随着p的逐渐增大，q渐趋饱和，B
[AgAb*] B [ Ag] p [Ab*] q 代入上式
放射免疫分析名词解释
放射免疫分析名词解释
放射免疫分析（RIA）是一种检测技术，可以用来测定多种体内物质，包括激素、细胞因子、蛋白质和抗原。
它可以应用于动物和人体，并且具有灵敏度高、可操作性好的优点，被广泛应用于临床和科研领域。
放射免疫分析由以下几个步骤构成：首先，将样本中待测物质结合到放射抗体中。
放射抗体是一种特异性抗体，能够特异性结合待测物质，避免其他物质干扰检测结果。
放射抗体可以是膜抗原抗体、非膜抗原抗体或者多肽抗体。
其次，将样本和放射抗体制成滴定曲线，测定放射抗体结合待测物质的含量。
最后，通过计算放射抗体浓度滴定曲线的相关系数来计算样本中的待测物质的含量。
放射免疫分析为临床和科研提供了许多方便，特别是在生理学方面，其应用极为广泛。
它可以用来检测各种激素、蛋白质和细胞因子的表达水平，对疾病的研究有重要意义。
放射免疫分析也可以检测各种抗原，为临床诊断疾病提供有力的支持。
放射免疫分析由于具有高灵敏度和特异性，可以很好地检测微量物质，在临床和科研领域具有重要的应用价值。
近年来，放射免疫分析在药物研发和食品质量检测方面也越来越受到重视，为科学研究和技术创新提供重要的技术支持。
综上所述，放射免疫分析是一种重要的检测技术，它不仅在临床检测中具有重要的应用价值，而且也受到越来越多科学研究和技术创新的重视。
它也可以帮助我们更准确、更早期地诊断疾病，为患者身
体健康提供有力的支撑。
放射免疫分析法
放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法。
于1960年由美国学者Yalow和Berson创立，并首先用于糖尿病患者血浆胰岛素含量的测定。
这是医学和生物学领域中方法学的一项重大突破，开辟了医学检测史上的一个新纪元。
它使得那些原先认为是无法测定的极微量而又具有重要生物学意义的物质得以精确定量，从而为进一步揭开生命奥秘打开了一条新的道路，使人们有可能在分子水平上重新认识某些生命现象的生化生理基础。
此后30年，内分泌学科的飞速进展充分证明了这一超微量分析技术的巨大推动力。
1977年，这项技术的发明者荣获诺贝尔生物医学奖。
随后这一崭新的技术迅速渗透到医学科学的其他领域，如病毒学、药理学、血液学、免疫学、法医学、肿瘤学等，以及与医学生物学相关的学科，如农业科学、生态学及环境科学等。
放射免疫分析的物质，由激素扩大到几乎一切生物活性物质。
我国放射免疫分析研究起步于1962年，并迅速发展与普及，对我国生物医学的进展起了很大的促进作用。
放射免疫分析由于敏感度高、特异性强、精密度高、并可测定小分子量和大分子量物质，所以在检验医学中应用极为广泛，常用于测定各种激素（如甲状腺激素、性激素、胰岛素等）、微量蛋白质、肿瘤标志物（如AFP、CEA、CA—125、CA—199等）和药物（如苯巴比妥、氯丙嗪、庆大霉素等）等。
各种检测项目均有试剂盒供应，而且仪器设备并不昂贵，所以在国内被广泛采用。
但由于核素的放射性对人体有一定的危害性，必须加以防护，核素实验室的建设须经防疫部门的监督，操作人员须经过特殊训练。
另外，由于核素有半衰期，试剂盒的货存期较短，因而放射免疫分析在应用中有诸多不便之处。
特别是近年来其他标记免疫分析技术如酶免疫分析、发光免疫分析等在技术上有飞跃的进展，高级仪器的自动化程度已可与生化自动分析仪相媲美，因此从长远前景看，放射免疫分析有被取代的趋势。
但在目前，从所需的设备和检测的费用上，放射免疫分析还有一定的优越性，还将在一定时期内被医学检验实验室所采用。
免疫放射分析法
免疫放射分析法一、原理免疫放射分析法 (Immunoradiometric assay, IRMA) 是用过量的放射核素标记抗体(*Ab) 和限量的抗原或半抗原(Ag) 结合，形成 Ag*Ab，其放射性和所加 Ag 的量呈正相关。
如以不同量的Ag标准品求出与Ag*Ab放射性的量效关系，即可从待测样品在相同条件下测得的Ag*Ab放射性求出待测样品的量。
[Ag] + [*Ab] [Ag*Ab]抗原过量抗体复合物1.从原理的角度讲，IRMA的主要特点包括以下几方面。
2.属于非竞争性抗原抗体结合反应。
3.抗原抗体复合物的量与所加非标记抗原的量呈正相关。
4.因为不存在竞争结合反应，低剂量区没有不确定因素，因此灵敏度较高。
5.分离步骤的主要目的是把 *Ab和Ag*Ab分开。
由于 *Ab和Ag*Ab都含球蛋白，分子量也比较接近，很多在RIA中常用的分离方法都不能用，需要用特异抗体作分离剂。
这在很大程度上造成了IRMA在方法学上的特殊性，即几乎全部是夹心法，也就是一个IRMA系统中需要两个抗体，都是针对同一个抗原的，但是抗原决定簇不同，一个抗体标记后作为探测抗体，一个抗体用作分离剂。
正是这一特点，使IRMA的测定对象主要限于有两个以上抗原决定簇的肽类或蛋白质。
6.由于Ag越小Ag*Ab放射性越低，所以在IRMA中NSB的高低对低剂量Ag测量的准确性影响大，如何降低NSB对灵敏度很重要。
二、试剂盒基本试剂试剂盒的基本要求和RIA试剂盒相同，由国家批准的生产单位提供，使用者应按说明书的要求合理使用。
如果临床工作需要，使用者可以对试剂稀释度、操作步骤等进行适当改动，但对改变了的方案应作精密度、准确度、灵敏度等考核，并作详细记录。
一般试剂盒都包括三种主要试剂：标记抗体、非标记标准抗原 (标准品)、分离试剂或材料，很多试剂盒还提供缓冲液及质量控制用的样品。
7.标记抗体标记抗体必须亲和力高、特异性高。
通常都由生产厂家精选后用125I标记，可以是多克隆(polyclonal)，也可以是单克隆(monoclonal)抗体。
放射免疫分析
放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性和抗原抗体反应特异性相结合的一种免疫技术。
放射免疫技术放射免疫分析免疫放射分析放射免疫分析技术的应用放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大的推动作用。
基本类型及原理1.放射免疫分析（RIA）2.免疫放射分析（IRMA）常用的放射性核素放射免疫技术常用的放射性核素有125Ⅰ、131Ⅰ、3H、14C等。
使用最广泛的是125Ⅰ，可采用探测γ射线的晶体闪烁计数器测量。
标志物制备及鉴定125Ⅰ以放射性碘原子通过置换被标志物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。
（1）氯胺T（ch-T）法。
（2）乳过氧化物酶标记法。
（3）间接标记法。
放射性标志物的纯化（1）凝胶过滤法：分子筛。
（2）离子交换层析法：极性差异。
（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）：电荷和直径。
（4）高效液相色谱法。
放射性标志物的鉴定1.放射化学纯度：大于95%。
2.免疫活性：标志物与抗体结合的能力。
3.比放射性：标志物中所含的放射性强度。
方法学评价除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标：（1）可靠性。
（2）剂量-反应曲线。
（3）高剂量钩状效应。
放射免疫分析放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合有限的特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析法。
Ag*+Ag+Ab Ag*-Ab+Ag-Ab+Ag*+Ag分离结合与游离标志物1.第二抗体沉淀法。
2.聚乙二醇（PEG）沉淀法。
3.PR试剂法：先将二抗与PEG按一定比例混合成悬液后进行试验。
4.活性炭吸附法。
放射性测量及数据处理可对标记抗原抗体复合物（B）或游离标记抗原（F）进行放射性测量，绘制标准曲线，查出相应的待检抗原浓度。
第七章 放射免疫分析
第七章放射免疫分析第一节放射免疫技术一、基本类型及原理（一）放射免疫分析（RIA）以放射性核素标记抗原与未标记抗原竞争结合特异性抗体，测定样品中抗原量的一种分析法。
（二）免疫放射分析（IRMA）用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。
二、常用的放射性核素125I、131I、3H、14C等，使用最广泛的是125I。
三、放射性标记物制备及鉴定（一）原理：以放射性碘原子置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。
蛋白质、肽类等含有上述基团，可用125Ⅰ直接标记，不含上述基团的甾体激素或药物分子，须连接相应基团才能用于放射性碘标记。
（二）标记及类型1.直接标记法：肽类、蛋白质和酶的碘化标记。
常用的方法为：①氯胺 T（ch-T）法；②乳过氧化物酶标记法。
2.间接标记法：也称连接标记法，是最常用的间接碘标记方法。
该法主用于甾体类化合物、环核苷酸、前列腺素等缺乏碘标记基团的小分子化合物的标记。
（三）放射标记物的纯化1.凝胶过滤法：分子筛机制。
2.离子交换层析法：游离125Ⅰ与标记物分子极性差异进行吸附解离。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）：按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同。
4.高效液相色谱法。
（四）放射标记的鉴定1.放射化学纯度：单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率，要求＞95%。
该参数还是观察在贮存期内标记物脱碘程度的重要指标。
2.免疫活性：制备的标记物与抗体结合的能力。
3.比放射活性：单位化学量标记物中所含的放射性强度，即每分子被标记物平均所结合放射性原子数目。
四、方法学评价除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标：（一）可靠性：又称健全性，是评价被测物与标准品的免疫活性是否相同。
借助标准曲线与样品稀释曲线的平行性分析来判断。
平行性好者可靠。
（二）剂量-反应曲线：通过已知浓度的标准品和相应的反应参数绘制成剂量-反应曲线，待测物定量是通过计算其反应参数在剂量-反应曲线上对应的标准品浓度值而确定。
《放射免疫分析》课件
03
在标记反应过程中进行实时监测，确保反应顺利进行
。
分离与测量
分离方法选择
01
根据实验需求选择合适的分离方法，如离心、过滤、层析等。
测量设备校准
02
确保测量设备准确无误，并进行必要的校准和验证。
测量过程控制
03
在测量过程中进行质量控制，确保测量结果的准确性和可靠性
。
结果分析
数据处理
对实验数据进行整理、统计和分析，提取有用的信息 。
应用领域的拓展
临床诊断
扩大在肿瘤、心血管、神经退行性疾病等 领域的诊断应用，提高疾病早期发现和治
疗效果评估的准确性。
生物医药研究
应用于新药研发、药物代谢、蛋白质组学 等领域，为生物医药研究提供有力支持。
环境监测与食品安全
拓展在环境污染物、农药残留、食品添加 剂等方面的检测应用，保障环境和食品安
全。
亲和层析
利用抗原抗体之间的特异性结合进 行分离。
04
测量方法
液体闪烁计数器
用于测量放射性核素发出的射线。
γ射线计数器
用于测量放射性核素发出的γ射线。
液体闪烁能谱仪
用于测量放射性核素发出的射线能谱。
γ射线能谱仪
用于测量放射性核素发出的γ射线能谱。
03
放射免疫分析的实验操作 流程
实验前的准备
实验器材和试剂准备
抗原-抗体反应
01
02
03
特异性
抗原与抗体之间的特异性 结合，决定了反应的特异 性。
亲和力
抗原与抗体之间的亲和力 决定了结合的牢固程度。
反应动力学
反应速度和平衡状态对实 验结果的影响。
分离技术
01
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加样： 1、Ag（系列标准品及待测样品）50ul/每管 2、Ag* 200ul/每管 3、Ab 100ul/每管 混匀，37℃ 45分钟，加分离剂离心，测定 结合部分放射性。
放射免疫分析的几种标准曲线图：
抗原抗体的结合反应遵循质量作用定律， 即：
当反应达到平衡时， k1[Ag][Ab]=k2[AgAb]。设KA为平衡结 合常数，也称亲和常数，则有：
Ag + Ab → AgAb + Ag* ↓ Ag*Ab
式中Ag *代表标记抗原，Ag代表非标 记抗原，Ab代表特异性抗体，Ag * Ab代 表标记抗原抗体复合物，AgAb代表非标 记抗原抗体复合物。
当反应体系中同时存在Ag、Ag *和Ab， 而Ag *的量一定、Ab的量限定（分子数少于抗 原）时，随着Ag的增加，Ag * Ab的量相应减 少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的 量呈负相关竞争性抑制。当反应达到平衡后， 将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的 标记抗原分离，测定其放射性。以标准抗原的 浓度为横坐标，以标记抗原抗体复合物的结合 率（B/T、B/F、B/B0）为纵坐标，绘制剂量 效应曲线（calibration curve），也称标准曲 线。
3）亲和力和亲和常数测定：亲和力表 示特定的抗原、抗体之间的结合能力， 常用亲和常数KA来表示。KA越大，表 示抗原、抗体之间结合能力越强，B/F 值大，方法的灵敏度高。 随着单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）技术的发展，提高 了现代体外分析技术的特异性和亲和力。
（二）、放射性标记物 放射性标记物是体外放射分析的测 量依据，常用的标记核素有125I和3H。 对标记物的质量要求包括： （1）比活度（specific activity）：体外 放射分析法的定量范围一般在10-9-1012mol水平，标记物的用量应等于或小于 被测物的最小量，以得到较好的灵敏度。 高比活度的标记物是确保分析方法灵敏 度的前提。
二、基本试剂
（一）、抗体（antibody）
(1)、抗体的制备：抗体是体外放射 分析中应用最广的结合剂，是用纯化 的免疫原免疫动物制备而得，免疫的 成败在于免疫原和动物种类以及注射 途径、佐剂的使用、注射剂量和时间 等。
分子量超过5000的蛋白多肽物质 具有较好的免疫原性，容易刺激高活 度的抗体形成。分子量小于5000的肽 类物质免疫原性低，需要与载体蛋白 结合方能引起明显的抗体形成。应该 指出，动物对抗原的免疫反应个体差 异很大，当一批动物用同样免疫原 和免疫程序进行免疫时，往往只有部 分动物产生满意的反应。
第一节 放射免疫分析
一、基本原理：放射免疫分析（radio
immunoassay，RIA）是体外放射分析技 术中建立最早、应用最广的一类技术， 其基本原理为竞争性抑制。即：放射性 标记抗原和非标记抗原（包括标准抗原 或待测抗原）共同与特异性抗体发生可 逆性结合，如图8-1。这种竞争可用以下 反应式来表达：
（2）抗血清（antiserum）的质量鉴定： 评价结合剂的主要指标有滴度、特异性和 亲和力。
1）滴度测定： 测定方法是将抗血清稀 释成不同浓度，分别加入一定量的标记 抗原，在适当的反应条件下达到平衡后， 分离B与F，计算不同稀释度的抗血清与 标记抗原的结合百分率，以结合百分率 为纵坐标，以抗血清稀释度为横坐标， 绘制抗血清稀释曲线（如图）。
k1和k2分别代表结合速度常数和解离速度常 数，[Ag]、[Ab]、[AgAb]分别代表游离抗原、游 离抗体和抗原抗体复合物的浓度。假设Ab0和Ag0 分别代表抗原、抗体的初始浓度，B和F分别代表 反应平衡时结合和游离抗原的%，（以分数表示， B+F=1），可以推导出B的函数式，
由上式可看出是以B为函数的一元二次方程。 对每一特定的RIA系统，[ Ab0]和KA是固定的， [*Ag0]也是固定的，所以B在直角坐标上随非标记 [ Ag0]呈双曲线走向。
（4）稳定性（stability）： 稳定性是指标记抗原在合理储存的条 件下，保持其全部性能不变的程度。许多 因素可影响其性能的稳定性，如标记方法、 标记位置、置换水平、理化环境等都可使 放射性核素从标记抗原的分子上脱落下来， 或造成标记分子聚合或解离，使放化纯度 明显下降。当标记方法合理，保存条件完 善时，货架期可达1-3月。
（三）、标准品（calibration standard）
标准品是样品定量的基础，它的质和量 的变化会直接影响样品的测定值。 对标准品 的要求包括： （1）标准品与待测物质应属同一物质； （2）在与结合剂发生反应时，应与待测配体 有相等的活性和亲和力； （3）高度纯化，不含影响分析的杂质； （4）标准品的定量一定要准确。
试剂盒组成：（以T4测定为例） 1、Ag (系列标准品)，浓度分别为： 0、20、40、80、160、320ng/ml 2、Ag*，125I-T4（红色，作为示踪剂） 3、Ab， 抗T4抗体（作为结合剂）
4、分离剂（免疫分离剂，结合反应达到平 衡后将结合部分与游离部分分开）
0
20
40
80
160 320 待1 待2
（2）放化纯度（radiochemical purity）： 一般要求标记物的放化纯度在95%以上， 若放射性杂质过多，标准曲线的斜率降低， 将会影响测定的灵敏度。 （3）免疫活性（immune activity）：标记 物在标记和储存等过程中会造成损伤，使 标记抗原的免疫活性下降，与抗体发生反 应的能力减弱，甚至丧失，因此抗原活性 的检测十分重要。要求标记抗原与待测抗 原具有相同的免疫活性。
选择结合率为50%时所对应的稀释度， 作为该结合剂的稀释度，该稀释度即为滴度。 抗体滴度越高表明抗体的质量越好。
2）特异性测定：抗血清的特异性是 指抗体与待测物以外的结构类似物 结合的程度（又称交叉反应率）。 交叉反应百分率 =[Y]50/[Z]50×100% 其中[Y]50为被测物结合率50% 时的浓度值；[Z]50为结构类似物结 合率50%时的浓度值。干扰轻者特 异性高。