第四章 体外放射分析技术

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分离方法的要求
分离完全、快速。 分离完全、快速。 不影响免疫反应的平衡， 不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中 不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。 不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。 受环境因素（温度、PH值等）的影响小。 受环境因素（温度、PH值等）的影响小。 值等 操作简便，分离剂来源丰富、价廉。 操作简便，分离剂来源丰富、价廉。
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放射性竞争 结合分析
放射免疫分析 (RIA)
体 外 分 析 技 术
体外放射分析
放射性非竞 争结合分析 免疫放射分析 (IRMA)
酶免疫分析 (EIA)
体外非放射分析
化学发光免疫分析 (CLIA) 荧光免疫分析 温州医学院核医学教研室 (FIA)
第一节
放射免疫分析法
Dr. Yalow
温州医Байду номын сангаас院核医学教研室
（五） 测量仪器
1. γ射线探测器（γ免疫计数器）
2.液体闪烁计数器(liquid scintillation counter)
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实验操作步骤
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1. 配制一系列已知浓度的标准 抗原Ag的反应管，并标明浓度； 2.分别向反应管中加入固定量 的*Ag、Ab； 3.经过一定时间的温育竞争结 合反应；
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4.待竞争结合反应平衡后，分 待竞争结合反应平衡后， 待竞争结合反应平衡后 离结合B Bond） 离结合B（Bond）部分和游 F(Free)部分 部分； 离F(Free)部分； 5.用放射性探测器测得 Ag用放射性探测器测得* 5.用放射性探测器测得*AgAb放射性为 或游离*Ag的 放射性为B Ab放射性为B或游离*Ag的 放射性为F 放射性为F；
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基本方法
㈠ 双抗体夹心法 ㈡ 标记第三抗体法 ㈢ 其他方法 ：生物素 - 亲和素系统
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RIA与IRMA的比较
RIA法 RIA法 标记物 原理 抗体量 标准曲线 达到平衡的速度 可测范围 应用对象 Ag 竞争性结合 限量 负相关 慢 窄 大分子、 大分子、小分子 IRMA法 IRMA法 Ab 非竞争性结合 过量 正相关 快 宽 大分子
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6.计算出结合率B%[B/ （B+F）×100]，或 B/B0%；B0为不含Ag 的结合率，因Ag为“0”， 故B0 *Ag-Ab的结合率 为最大结合率；
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7.以B%或B/B0为纵坐标，标 准抗原浓度为横坐标，绘制出 B%或B/B0随Ag量变化的曲 B% B/B0 Ag 线即为标准曲线（图4-2）。
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RIA与非放射性标记免疫分析技术性能比较 RIA与非放射性标记免疫分析技术性能比较
RIA 示踪物 反应条件 操作程序 分析自动化 分离B,F 分离 稳定性
标记物有效期
影响结果的因素
125I
EIA 酶 固 简易 否 洗涤 较差 较长 多 较短
CLIA
酶,吖啶酯 吖啶酯 固
ECLIA
1、精密度（precision） 、精密度（ ） 变异系数（ 变异系数（ CV ）7%~10% 2、准确度（accuracy） 、准确度（ ） 回收率=测定值 真实值 回收率 测定值/真实值×100% 测定值 真实值× 90%~110%
B A C
4、特异性（specificity） 、特异性（ ） 交叉反应率 5、可靠性（validity） 、可靠性（ ） 平行性试验
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免疫放射分析法 (IRMA)
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原
理
1. 利用125I标记抗体作示踪剂与非标记抗 标记抗体作示踪剂与非标记抗
原（待测样品或标准品）形成复合物， 待测样品或标准品）形成复合物， 除去多余的游离抗体， 除去多余的游离抗体，测量复合物的放 射性 灵敏度比放射免疫分析法有明显提高， 2. 灵敏度比放射免疫分析法有明显提高， 且标准曲线的测量范围也明显扩大
放射免疫分析法 (RIA)
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原 理
竞争性的抑制反应 Ag+Ab （F）+ ） * Ag Ag Ab （B） ）
* Ag Ab Ag和*Ag Ab间呈负相关函数关系 和 间呈负相关函数关系
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二、必备条件
（一）抗体 1.亲和力 1.亲和力 2.特异性 2.特异性 3.滴度 3.滴度 （二）标记抗原 非标记抗原（标准品） （三）非标记抗原（标准品）
第四章 体外分析技术
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概
论
1959 Berson & Yalow RIA
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体外分析技术是结合了放射性核素的高 灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超 微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、 微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精 灵敏度高 密度好、应用面广、方法简便等优点。 密度好、应用面广、方法简便等优点。 等优点
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2.标记抗原 标记抗原
1）比活度和放化纯度足够高 ）比活度和放化纯度足够高
比活度——每微克抗原 每微克抗原 比活度 上标记放射性核素的千 贝可数（ 贝可数（KBq/µg） ） 放化纯度——具有免疫 具有免疫 放化纯度 活性的标记抗原占总放 射性的百分数。 射性的百分数。 >90%
3、灵敏度 （sensitivity） 、 ） 方法的最小可测量
6、稳定性（stability） 、稳定性（ ） B0%，NSB，ED25，ED50，ED75 ， ， 温州医学院核医学教研室
五、 质量控制
㈠ 质量控制的目的 ㈡ 内部质控
随机误差 系统误差
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1.最高结合率（B0%） 2.非特异结合率（NSB%） 3.标准曲线直线回归的参数 4.ED25，ED50，ED75 5.反应误差关系（RER） 6.质控图（quality control profile）
2）半衰期足够长 ） 3）保持原有抗原的特性 ） 大分子： 大分子：125I 小分子： 小分子：3H or 125I 温州医学院核医学教研室
3.非标记抗原 非标记抗原 标准品） （标准品）
高纯度 化学结构、 化学结构、免疫活性与被测抗原相同
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分离方法
（一） 液相分离技术 （二） 固相分离技术
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特点： 特点： 1 属于非竞争性抗原、抗体结合反应 属于非竞争性抗原、 2 抗原 抗体复合物的量与所加非标记 抗原-抗体复合物的量与所加非标记 抗原的量呈正相关 3 在低剂量区不会有不确定因素 4 免疫放射分析法的非特异结合对低 量区结合影响大， 剂 量区结合影响大，对分离条件的要求 非常严格
(Radioimmunoassa y)
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在体外条件下, 利用Ag与定量的 与定量的*Ag对限量的特异性 对限量的特异性Ab 在体外条件下 利用 与定量的 对限量的特异性 的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出 的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量 的一种超微量分析技术。 的一种超微量分析技术。
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60
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8.在相同条件下，测得被测样 品Ag的B%或样品/B0%的浓 度与标准曲线对照，即可查出 被测样品Ag的浓度。
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四、 主要技术指标
（一）精密度 （二）灵敏度 （三）准确度
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control） 三、质量控制（quality control）
Ru(BPP)2 +
TRFIA Eu3+ 固 简易 可 洗涤 高 长 多 长
液,固 固 简易 否
离心,洗涤 离心 洗涤
温育时间
高 短 多 长
简易 可 洗涤 高 长 少 较短
固 简易 可
洗涤,均相 洗涤 均相
高 长 少 较短
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临床应用（见表4 临床应用（见表4－2）p40
一、蛋白质和肽类激素 二、半抗原 三、病原体抗原 四、肿瘤标志物
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放射免疫分析方法 免疫放射分析方法 放射酶分析方法 酶放射分析方法 放射受体分析方法 受体放射分析方法 竞争性蛋白结合分析方法
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非放射性标记免疫分析技术
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类
型
一、酶标记免疫分析技术 二、化学发光免疫分析技术 三、时间分辨荧光免疫分析
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三、分离方法 （一）液相分离技术 1.双抗体沉淀法 1.双抗体沉淀法 2.聚乙二醇法 聚乙二醇法(PEG) 2.聚乙二醇法(PEG) 3.葡萄球菌 蛋白(SPA) 葡萄球菌A (SPA)沉淀法 3.葡萄球菌A蛋白(SPA)沉淀法 4.活性炭吸附法 4.活性炭吸附法 （二）固相分离技术
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