核酸分子杂交技术
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结构，以保持其单链线形状态
44
第二节 核酸分子杂交的类型
四、原位杂交
原位杂交（In situ hybridization ）是以特定标 记的核酸探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交 并用组化或免疫组化等方法对其检测的技术。
它属于固相分子杂交的范畴，但有别于其它任何 固相核酸分子杂交技术
45
第二节 核酸分子杂交的类型
1.放射自显影 将杂交膜与X胶片在暗盒中曝光一定时间
2.液体闪烁计数法--γ计数器 杂交膜剪成小块，真空干燥后转入闪烁瓶， 加入闪烁液，在液闪仪上自动计数
28
第一节 核酸探针
四、探针的检测-非放射性的探针的检测
1．酶促显色法 2．荧光法 3．化学发光法 4．多探针检测法
非放射性探针检测示意图 29
第二节 核酸分子杂交的类型
一、反向点杂交
二、Southern印迹杂交
三、Northern印迹杂交 四、原位杂交 其它命名如：斑点杂交
菌落杂交 微板酶联杂交
31
第二节 核酸分子杂交的类型
杂交分类
按照杂交的反应条件分为固相和液相杂交两类：
固相杂交 ➢ 探针 ➢ 被测DNA（RNA） ➢ 在固体支持物上杂交 ➢ 容易洗膜
第二节 核酸分子杂交的类型
二、Southern印迹杂交
DNA变性 中和 Southern印迹 预杂交 杂交 洗膜 检测
39
第二节 核酸分子杂交的类型
二、Southern印迹杂交
毛细管转移示意图
40
第二节 核酸分子杂交的类型
二、Southern印迹杂交
电转移示意图
41
第二节 核酸分子杂交的类型
46
第二节 核酸分子杂交的类型
四、原位杂交-原位杂交材料
•石蜡包埋组织切片 •冰冻切片 •细胞涂片 •培养细胞爬片
15
第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类
核酸探针（nucleic acid probe)：
• 是特定核苷酸序列（单 链，被标记）
• 与靶序列发生特异性互 补（可杂交）
• 杂交后可用特殊方法检 测的已知被标记的核酸 分子
16
第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类
• 确定特定核苷酸序列（与靶序列互补） • 标记（检测方法）
• RNA分子中不存在高度重复序列，非特异性杂交少， 杂交后未杂交的探针分子水解可用RNA酶去除，本 底的干扰低。
• RNA探针有易降解和标记方法复杂等缺点，限制了 其广泛应用。
21
第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类-寡核苷酸探针
• 特点 :
– 探针长度较短（一般为17～50bp） – 人工合成（避免天然探针的缺点） – 尤其适合点突变的检测 – 由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱 ，
25
第一节 核酸探针
三、核酸探针的标记
1．随机引物法 （单链） 2.缺口平移法（双链）
26
第一节 核酸探针
三、核酸探针的标记
3．全程RNA探针标记 4．化学法全程标记
生物素-亲和素 地高辛-抗地高辛抗体 5．3'末端标记 6．5'末端标记
27Fra Baidu bibliotek
第一节 核酸探针
四、探针的检测-放射性同位素探针的检测
7
二、核酸变性与复性
变性DNA的性质：变性能导致DNA 的一些理化 性质及生物学性质发生改变
– 溶液粘度降低
• DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以 “柔软” 无规则单股线性结构，DNA粘度明显下降
– 溶液旋光性发生改变
• 变性后DNA分子的对称性及局部构型改变
– 紫外吸收增加
• DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收增强 • 双链DNA＜单链DNA＜单核苷酸
理想的探针标记物应具有以下特点
– 特异：靶序列特异 – 稳定：标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，
尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值 – 灵敏：标记物被检测 – 无毒：标记物对环境污染小，对人体无损伤 – 简便：操作简单 – 便易：价格低廉
24
第一节 核酸探针
三、核酸探针的标记
常用的探针标记物：
– 放射性同位素标记：32P – 非放射性同位素标记：生物素，地高辛，荧光素
但经过精心设计仍可设计出非常 特异的寡核苷酸探针
22
第一节 核酸探针
二、核酸探针的长度
• DNA，RNA探针
– DNA探针：400-500base – RNA探针：不易控制，重组DNA分子线性化的限制性核酸
内切酶的位点
• 寡核苷酸探针
– 探针长度：一般要求在17～50bp
23
第一节 核酸探针
三、核酸探针的标记
第一节 核酸探针
常用核酸探针的标记和检测
标记物性质 放射性分子
非放射性分子 生物素
酶
荧光素 半抗原
标记分子 [α32P ]dNTP [γ32P ]dNTP 35S
标记方法 NT、PCR、RP TL NT
检测方法 放射自显影或计数 放射自显影或计数 放射自显影或计数
Bio-11-dUTP 光敏生物素 生物素化补骨脂素 过氧化物酶
一、反向点杂交
• 反向点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程 简便、快速
• 一张膜上可以同时固定多个探针，进行多个位点 检测
• 特别适合做点突变
36
第三节 核酸分子杂交技术
一、反向点杂交
线粒体DNA的8个突变位点膜杂交结果
C3 256T G 3 316 A G 3 688 C 3 316 G→A 3 606 A→G 3 618 T→C
11
二、核酸变性与复性
复性（renaturation）：指变性 DNA 在适当条 件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺 旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程
• 杂交双链（hybrid duplex）
– DNA-DNA – DNA-RNA – RNA-RNA
12
三、核酸分子杂交基本原理
分子杂交（molecular hybridization）:单链的核酸分 子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形 成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。
34
第二节 核酸分子杂交的类型
一、反向点杂交（reverse dot blot，RDB）
点杂交
正向：是将待检样（DNA、 RNA 或细胞）直接点到 膜上，烘烤固定
反向：是将探针固定在膜上
1.将标记 的探针固 定在膜上
2.真空抽滤 3.烘干
4.与待测DNA 杂交 5.洗脱显影
35
第二节 核酸分子杂交的类型
8
二、核酸变性与复性
融解温度（ melting temperature，Tm）： 在热变性过程中，DNA的变性会在一个狭窄的温 度范围内发生，当紫外吸收值达到最大值的50% 时的温度称为DNA的解链温度或融解温度
• 增色效应与温度有十分密切的关系，这主要是变 性温度取决于DNA自身的性质。
9
二、核酸变性与复性
Northern印迹 杂交流程图
43
第二节 核酸分子杂交的类型
三、Northern印迹杂交
与Southern印迹杂交比较：
– RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染 – 所用的器材最好与Southern印迹实验的分开使用 – RNA变性的方法：不能用碱变性，因为碱会水解
RNA 2’-OH – 变性剂的作用：防止RNA分子形成发夹式的二级
可以是两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条 RNA链
核酸杂交示意图
13
三、核酸分子杂交基本原理
• 杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链 实现复性
• 分子杂交技术：利用探针（probe）与靶DNA （RNA）杂交，特异性识别靶DNA（RNA）
14
第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类 二、核酸探针的长度 三、核酸探针的标记 四、核酸探针的检测
• 制备方法: – 基因克隆的方法 – 聚合酶链反应(PCR)
• 特点: – 克隆在载体中的DNA片段，可无限繁殖，制备简便 – 相对RNA而言，DNA探针不易降解 – 标记方法也较成熟
19
第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类-cDNA探针
• cDNA（complementary DNA）：是指与mRNA 互补的DNA分子
• Tm的影响因素：
1． DNA分子大小和碱基 的组成
2．溶液的离子强度 3． pH值 4．变性剂
DNA复杂度对Tm的影响 10
二、核酸变性与复性
• DNA的（G+C）含量
• 在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取 决于DNA分子中的（G+C）的含量
• （G+C）含量越高，G-C 碱基对越多， Tm 值越高。 – 因G-C碱基对具有3对氢键，而A-T 碱基对只有2对氢键，DNA中 （G+C）含量高显然更能增强结构 的稳定性，破坏 G-C间氢键需比A-T 氢键付出更多的能量。
• 二级结构：双螺旋结构 – 稳定键：氢键、碱基堆积力
• 高级结构：染色体
4
一级结构 二级结构 高级结构
C A
G
5
二、核酸变性与复性
变性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，维系 DNA分子二级结构的氢键断裂，DNA的双螺旋解开变成 单链，形成无规则线团。
6
二、核酸变性与复性
DNA的变性因素：凡能破坏双螺旋稳定性的 因素都可以成为变性的条件 – 加热 – 极端的pH – 有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）
• 特点: – 不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想 的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究
– 排除了RNA酶的影响，现已成为分子生物学实 验室的常规实验
20
第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类-RNA探针
• RNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高
–RNA分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链的 竞争结合
3 394 T→C
3 593 T→C 3 290 T→C
37
第二节 核酸分子杂交的类型
二、Southern印迹杂交
• Southern印迹杂交是应用DNA探针检测特异 DNA的一种膜上印迹技术
• 是由英国爱丁堡大学的E.M.Southern于1975年 建立的。
• 主要用于分析基因是否发生突变
38
四、原位杂交
• 原位杂交技术除了具有核酸分子杂交的特异性高的特点 之外，并可精确定位，因此该技术已广泛地应用于医学 分子生物学的研究之中
• 其应用有以下几方面：
– 正常或异常染色体的基因定位
– 应用核酸探针与细胞内RNA进行杂交，检测基因表 达水平
– 应用特异的病原体核酸作为探针对组织、细胞进行 杂交，以检测有无该病原体的感染等
三、Northern印迹杂交
• Northern印迹(Northern blot)杂交是应用DNA探 针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术
• 是由Alwine于1977年建立的。后经Thomas等人 改进
• 主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的转录情 况
42
第二节 核酸分子杂交的类型
三、Northern印迹杂交
33
第二节 核酸分子杂交的类型
核酸分子杂交技术类型
杂交类型
反向点杂交 Southern印迹杂交
检测目的及范围
将探针固定在膜上，反向检测DNA或RNA分子 检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子
Northern印迹杂交 原位杂交
检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子 检测细胞或组织中的DNA或RNA分子
核酸分子杂交技术
Nucleic acid Hybridization
1
主要内容
• 第一节 核酸探针 • 第二节 核酸分子杂交的类型 • 第三节 杂交的影响因素
2
回顾：核酸杂交的基本原理
一、核酸的结构 二、核酸变性与复性 三、核酸分子杂交的基本原理
3
一、核酸的结构
• 一级结构：核苷酸的排列顺序 – 稳定键：磷酸二酯键
液相杂交
➢ 探针 ➢ 被测DNA（RNA） ➢ 在液体中杂交 ➢ 灵敏度高
• 正向杂交（靶序列固定） • 反向杂交（探针固定）
32
第二节 核酸分子杂交的类型
分子杂交技术一般过程
☆ 探针制备及标记（同位素或非同位素） ☆ 待测核酸样品制备（分离，纯化） ☆ 杂交（液相，固相，原位杂交） ☆ 杂交后处理（去掉非特异杂交分子） ☆ 显示结果（显色，发光，放射自显影） ☆ 结果分析
碱性磷酸酶
罗丹明和FITC
地高辛
NT、PCR、RP 600W可见光照 365紫外线照 化学合成法或直接法
化学合成法或直接法
合成法
RP、NT
酶标亲和素或酶标 抗生物素抗体显色 抗生物素抗体显色 直接底物显色或用酶 抗体+底物显色 直接底物显色或用酶
抗体+底物显色 荧光显微镜观察或酶 标抗体+底物显色 酶标抗体+底物3显0 色
• 选择探针的最基本的要求
• 高度特异性 • 探针的来源是否方便 • 制备探针的难易程度
17
第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类
–DNA探针 –cDNA探针 –DNA探针
–RNA探针 –寡核苷酸探针
18
第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类-DNA探针
• 来源：这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的 全部或部分序列
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第二节 核酸分子杂交的类型
四、原位杂交
原位杂交（In situ hybridization ）是以特定标 记的核酸探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交 并用组化或免疫组化等方法对其检测的技术。
它属于固相分子杂交的范畴，但有别于其它任何 固相核酸分子杂交技术
45
第二节 核酸分子杂交的类型
1.放射自显影 将杂交膜与X胶片在暗盒中曝光一定时间
2.液体闪烁计数法--γ计数器 杂交膜剪成小块，真空干燥后转入闪烁瓶， 加入闪烁液，在液闪仪上自动计数
28
第一节 核酸探针
四、探针的检测-非放射性的探针的检测
1．酶促显色法 2．荧光法 3．化学发光法 4．多探针检测法
非放射性探针检测示意图 29
第二节 核酸分子杂交的类型
一、反向点杂交
二、Southern印迹杂交
三、Northern印迹杂交 四、原位杂交 其它命名如：斑点杂交
菌落杂交 微板酶联杂交
31
第二节 核酸分子杂交的类型
杂交分类
按照杂交的反应条件分为固相和液相杂交两类：
固相杂交 ➢ 探针 ➢ 被测DNA（RNA） ➢ 在固体支持物上杂交 ➢ 容易洗膜
第二节 核酸分子杂交的类型
二、Southern印迹杂交
DNA变性 中和 Southern印迹 预杂交 杂交 洗膜 检测
39
第二节 核酸分子杂交的类型
二、Southern印迹杂交
毛细管转移示意图
40
第二节 核酸分子杂交的类型
二、Southern印迹杂交
电转移示意图
41
第二节 核酸分子杂交的类型
46
第二节 核酸分子杂交的类型
四、原位杂交-原位杂交材料
•石蜡包埋组织切片 •冰冻切片 •细胞涂片 •培养细胞爬片
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第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类
核酸探针（nucleic acid probe)：
• 是特定核苷酸序列（单 链，被标记）
• 与靶序列发生特异性互 补（可杂交）
• 杂交后可用特殊方法检 测的已知被标记的核酸 分子
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第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类
• 确定特定核苷酸序列（与靶序列互补） • 标记（检测方法）
• RNA分子中不存在高度重复序列，非特异性杂交少， 杂交后未杂交的探针分子水解可用RNA酶去除，本 底的干扰低。
• RNA探针有易降解和标记方法复杂等缺点，限制了 其广泛应用。
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第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类-寡核苷酸探针
• 特点 :
– 探针长度较短（一般为17～50bp） – 人工合成（避免天然探针的缺点） – 尤其适合点突变的检测 – 由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱 ，
25
第一节 核酸探针
三、核酸探针的标记
1．随机引物法 （单链） 2.缺口平移法（双链）
26
第一节 核酸探针
三、核酸探针的标记
3．全程RNA探针标记 4．化学法全程标记
生物素-亲和素 地高辛-抗地高辛抗体 5．3'末端标记 6．5'末端标记
27Fra Baidu bibliotek
第一节 核酸探针
四、探针的检测-放射性同位素探针的检测
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二、核酸变性与复性
变性DNA的性质：变性能导致DNA 的一些理化 性质及生物学性质发生改变
– 溶液粘度降低
• DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以 “柔软” 无规则单股线性结构，DNA粘度明显下降
– 溶液旋光性发生改变
• 变性后DNA分子的对称性及局部构型改变
– 紫外吸收增加
• DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收增强 • 双链DNA＜单链DNA＜单核苷酸
理想的探针标记物应具有以下特点
– 特异：靶序列特异 – 稳定：标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，
尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值 – 灵敏：标记物被检测 – 无毒：标记物对环境污染小，对人体无损伤 – 简便：操作简单 – 便易：价格低廉
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第一节 核酸探针
三、核酸探针的标记
常用的探针标记物：
– 放射性同位素标记：32P – 非放射性同位素标记：生物素，地高辛，荧光素
但经过精心设计仍可设计出非常 特异的寡核苷酸探针
22
第一节 核酸探针
二、核酸探针的长度
• DNA，RNA探针
– DNA探针：400-500base – RNA探针：不易控制，重组DNA分子线性化的限制性核酸
内切酶的位点
• 寡核苷酸探针
– 探针长度：一般要求在17～50bp
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第一节 核酸探针
三、核酸探针的标记
第一节 核酸探针
常用核酸探针的标记和检测
标记物性质 放射性分子
非放射性分子 生物素
酶
荧光素 半抗原
标记分子 [α32P ]dNTP [γ32P ]dNTP 35S
标记方法 NT、PCR、RP TL NT
检测方法 放射自显影或计数 放射自显影或计数 放射自显影或计数
Bio-11-dUTP 光敏生物素 生物素化补骨脂素 过氧化物酶
一、反向点杂交
• 反向点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程 简便、快速
• 一张膜上可以同时固定多个探针，进行多个位点 检测
• 特别适合做点突变
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第三节 核酸分子杂交技术
一、反向点杂交
线粒体DNA的8个突变位点膜杂交结果
C3 256T G 3 316 A G 3 688 C 3 316 G→A 3 606 A→G 3 618 T→C
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二、核酸变性与复性
复性（renaturation）：指变性 DNA 在适当条 件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺 旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程
• 杂交双链（hybrid duplex）
– DNA-DNA – DNA-RNA – RNA-RNA
12
三、核酸分子杂交基本原理
分子杂交（molecular hybridization）:单链的核酸分 子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形 成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。
34
第二节 核酸分子杂交的类型
一、反向点杂交（reverse dot blot，RDB）
点杂交
正向：是将待检样（DNA、 RNA 或细胞）直接点到 膜上，烘烤固定
反向：是将探针固定在膜上
1.将标记 的探针固 定在膜上
2.真空抽滤 3.烘干
4.与待测DNA 杂交 5.洗脱显影
35
第二节 核酸分子杂交的类型
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二、核酸变性与复性
融解温度（ melting temperature，Tm）： 在热变性过程中，DNA的变性会在一个狭窄的温 度范围内发生，当紫外吸收值达到最大值的50% 时的温度称为DNA的解链温度或融解温度
• 增色效应与温度有十分密切的关系，这主要是变 性温度取决于DNA自身的性质。
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二、核酸变性与复性
Northern印迹 杂交流程图
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第二节 核酸分子杂交的类型
三、Northern印迹杂交
与Southern印迹杂交比较：
– RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染 – 所用的器材最好与Southern印迹实验的分开使用 – RNA变性的方法：不能用碱变性，因为碱会水解
RNA 2’-OH – 变性剂的作用：防止RNA分子形成发夹式的二级
可以是两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条 RNA链
核酸杂交示意图
13
三、核酸分子杂交基本原理
• 杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链 实现复性
• 分子杂交技术：利用探针（probe）与靶DNA （RNA）杂交，特异性识别靶DNA（RNA）
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第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类 二、核酸探针的长度 三、核酸探针的标记 四、核酸探针的检测
• 制备方法: – 基因克隆的方法 – 聚合酶链反应(PCR)
• 特点: – 克隆在载体中的DNA片段，可无限繁殖，制备简便 – 相对RNA而言，DNA探针不易降解 – 标记方法也较成熟
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第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类-cDNA探针
• cDNA（complementary DNA）：是指与mRNA 互补的DNA分子
• Tm的影响因素：
1． DNA分子大小和碱基 的组成
2．溶液的离子强度 3． pH值 4．变性剂
DNA复杂度对Tm的影响 10
二、核酸变性与复性
• DNA的（G+C）含量
• 在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取 决于DNA分子中的（G+C）的含量
• （G+C）含量越高，G-C 碱基对越多， Tm 值越高。 – 因G-C碱基对具有3对氢键，而A-T 碱基对只有2对氢键，DNA中 （G+C）含量高显然更能增强结构 的稳定性，破坏 G-C间氢键需比A-T 氢键付出更多的能量。
• 二级结构：双螺旋结构 – 稳定键：氢键、碱基堆积力
• 高级结构：染色体
4
一级结构 二级结构 高级结构
C A
G
5
二、核酸变性与复性
变性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，维系 DNA分子二级结构的氢键断裂，DNA的双螺旋解开变成 单链，形成无规则线团。
6
二、核酸变性与复性
DNA的变性因素：凡能破坏双螺旋稳定性的 因素都可以成为变性的条件 – 加热 – 极端的pH – 有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）
• 特点: – 不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想 的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究
– 排除了RNA酶的影响，现已成为分子生物学实 验室的常规实验
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第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类-RNA探针
• RNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高
–RNA分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链的 竞争结合
3 394 T→C
3 593 T→C 3 290 T→C
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第二节 核酸分子杂交的类型
二、Southern印迹杂交
• Southern印迹杂交是应用DNA探针检测特异 DNA的一种膜上印迹技术
• 是由英国爱丁堡大学的E.M.Southern于1975年 建立的。
• 主要用于分析基因是否发生突变
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四、原位杂交
• 原位杂交技术除了具有核酸分子杂交的特异性高的特点 之外，并可精确定位，因此该技术已广泛地应用于医学 分子生物学的研究之中
• 其应用有以下几方面：
– 正常或异常染色体的基因定位
– 应用核酸探针与细胞内RNA进行杂交，检测基因表 达水平
– 应用特异的病原体核酸作为探针对组织、细胞进行 杂交，以检测有无该病原体的感染等
三、Northern印迹杂交
• Northern印迹(Northern blot)杂交是应用DNA探 针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术
• 是由Alwine于1977年建立的。后经Thomas等人 改进
• 主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的转录情 况
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第二节 核酸分子杂交的类型
三、Northern印迹杂交
33
第二节 核酸分子杂交的类型
核酸分子杂交技术类型
杂交类型
反向点杂交 Southern印迹杂交
检测目的及范围
将探针固定在膜上，反向检测DNA或RNA分子 检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子
Northern印迹杂交 原位杂交
检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子 检测细胞或组织中的DNA或RNA分子
核酸分子杂交技术
Nucleic acid Hybridization
1
主要内容
• 第一节 核酸探针 • 第二节 核酸分子杂交的类型 • 第三节 杂交的影响因素
2
回顾：核酸杂交的基本原理
一、核酸的结构 二、核酸变性与复性 三、核酸分子杂交的基本原理
3
一、核酸的结构
• 一级结构：核苷酸的排列顺序 – 稳定键：磷酸二酯键
液相杂交
➢ 探针 ➢ 被测DNA（RNA） ➢ 在液体中杂交 ➢ 灵敏度高
• 正向杂交（靶序列固定） • 反向杂交（探针固定）
32
第二节 核酸分子杂交的类型
分子杂交技术一般过程
☆ 探针制备及标记（同位素或非同位素） ☆ 待测核酸样品制备（分离，纯化） ☆ 杂交（液相，固相，原位杂交） ☆ 杂交后处理（去掉非特异杂交分子） ☆ 显示结果（显色，发光，放射自显影） ☆ 结果分析
碱性磷酸酶
罗丹明和FITC
地高辛
NT、PCR、RP 600W可见光照 365紫外线照 化学合成法或直接法
化学合成法或直接法
合成法
RP、NT
酶标亲和素或酶标 抗生物素抗体显色 抗生物素抗体显色 直接底物显色或用酶 抗体+底物显色 直接底物显色或用酶
抗体+底物显色 荧光显微镜观察或酶 标抗体+底物显色 酶标抗体+底物3显0 色
• 选择探针的最基本的要求
• 高度特异性 • 探针的来源是否方便 • 制备探针的难易程度
17
第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类
–DNA探针 –cDNA探针 –DNA探针
–RNA探针 –寡核苷酸探针
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第一节 核酸探针
一、核酸探针的种类-DNA探针
• 来源：这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的 全部或部分序列