病毒接种、收获尿囊液操作步骤

病毒接种

1.选胚：首先，在照蛋间挑选出血管模糊，没有生命迹象得鸡胚。

2.标记注射点:接着用记号笔在气室上方约１ｍm处画线，在线得下方挑选

注射点,在挑选注射点时应注意避开主血管,避开鸡头。

3、打孔：打孔前先用碘酊在气室部位消毒,用打孔器在气室线上方打孔。注意：

孔不宜过大,否则会导致封蜡不完全,甚至将蜡油流进鸡胚内部。

４、注射病毒：用注射枪向每个鸡蛋孔内注射0、2ｍl病毒稀释液，注射时针头朝向注射点方向,每次注射停留４～6s.

５、封蜡：注射完毕,用镊子夹取酒精棉沾上蜡油，进行鸡胚封蜡.

６、培养:将封蜡完成得鸡胚放入孵化箱中培养。孵化箱温度设置3３～35℃，湿度50％~70％,甲型流感病毒培养48～５２小时，乙型流感病毒培养

６6～７２小时。

需准备得仪器试剂:

手电筒,记号笔，碘酊,棉签，量筒（稀释)，酒精灯,废液瓶,打孔器，三脚架，蜡块,

连续注射器，一次性注射器,移液枪，移液枪枪头,镊子，纱布,打火机,蓝盖瓶。

注意事项:

(1）、前一天将病毒原液拿至4℃冷库;

(2）、前一天准备好需要灭菌消毒得物品，高温高压灭菌，烘干；确定好参加实验人数,准备好无菌服;

(3）、接种当天早上将接种所需生物安全柜开紫外杀菌;

收获尿囊液

1.鸡胚消毒:将培养好得鸡胚放入4℃冷库进行冷胚６ｈ以上；首先，用０、1％

得新洁而灭溶液将鸡胚进行消毒，每次消毒1～2分钟。接着,在鸡胚得气室用碘酊消毒.

2.烙蛋：将经过消毒处理得鸡胚在烙蛋器上进行烙蛋.

3.收获：先用小镊子将壳膜撕破扒出气室，再用大镊子压住鸡头,同时用5ｍl

移液枪吸取尿囊液。收获得尿囊液应就是澄清、微黄状。

4.保存:将收获得尿囊液放至６℃冷库保存。

需准备得仪器试剂:

新洁而灭溶液，碘酊，棉签,烙蛋器，废液瓶，镊子，５ml移液枪，５ml移液枪枪头,蓝盖瓶(数量由病毒原液体积决定)。

注意事项：

(1）、前一天准备好需要灭菌消毒得物品,高温高压灭菌,烘干;确定好参加实验人数,准备好无菌服；

（２）、收获当天早上将收获所需生物安全柜开紫外杀菌；

血凝滴度试验

1.稀释病毒液:取一块洁净得“９６”孔血凝板，横向摆放。用微量移液器

（20—200ul）加入磷酸盐缓冲液100ul至第一孔，横向从第二孔开始，每孔均用微量移液器（５—50ul)加入磷酸盐缓冲液25ul直至第十二孔。

2.倍比稀释:在“Ｕ”型96孔血凝板得左侧标记样品名称,用微量移液器（5—

５0ul)从第一孔内加入２５ul病毒悬浮液吹打混匀，将病毒液稀释五倍。取出25uｌ放到第二孔中，从第二孔开始倍比稀释，每孔吹打混匀,稀释到最后一孔弃掉25uｌ，此时得稀释倍数为1:10２40.

3.阴性对照：在同一块“U”型96孔血凝板得最后一排,后三孔用25ul得磷酸

盐缓冲液替代供试品，作为阴性对照。

4.加鸡血:将1%鸡红细胞悬液倒入加样槽吹打混匀，开始从第十二列至第一

列每孔均用微量移液器（5-５０μｌ)加入25μl得 1%鸡红细胞悬液,振荡均匀后置室温40分钟后观察结果。

５、结果计算:观察阴性对照,若红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感,将板倾斜片刻,可见红细胞滑动呈泪滴状为“－”，则阴性对照成立。

按照《流感病毒血凝滴度检测标准操作规程》观察每孔凝集状态,结果以“++”(++以数字2代之）为终点，以红细胞形成一个环状,四周有小凝集块者为“++”亦即一个凝集单位,也就就是说最高稀释度病毒能引起“++”号得红细胞凝集为终点,此稀释度得倒数为红细胞凝集滴度简称血凝滴度。

１、红细胞悬液浓度：来源于不同个体鸡得红细胞，对抗原得敏感性不尽相同。因此实验时最好用3—4只未免疫鸡。配制红细胞时，红细胞浓度低，HI滴度就会下降；红细胞浓度高,ＨＩ滴度就会上升。有实验表明,红细胞浓度增加一倍,HI滴度就会上升20、7—0、９,因此，红细胞浓度以１％为宜.

２、抗原得稀释倍数:配制抗原时，浓度必须准确。当抗原浓度高时，（ＨI)抗体效价就下降；当抗原浓度抵时，（HI）抗体效价就上升.

3、实验用得稀释液(PＢS)：稀释液得pH值对实验有影响。稀释液得pＨ值5、8以下,红细胞容易产生自凝现象;pＨ值在7、8以上凝集图形易消失,也会造成实验误差。而pH值为７、０时,红细胞沉降最充分，图形最清晰,HI效价也最高,因此实验时用ph7、0—7、2得稀释液。

4、实验时得温度：实验时得温度，从4—３7℃,随着温度上升,ＨA与HI滴度提高,但在3７℃时,凝集得红细胞易洗脱;４℃以下红细胞易产生自凝,故操作常用1８-22℃。

(以上所阐述得就是实验室操作过程中存在得几点因素,在实际工作中,也存在

着其她诸多原因,如采样得时间、采样得数量、以及由疫苗产生得影响等.）

流感病毒裂解疫苗生产工艺流程相关参数

超滤浓缩30０KＤ

蔗糖密度梯度离心30００0rpm，3h(55%+３０％+样品) 超滤除糖30０KD

除菌过滤0、２2ｕm

裂解裂解剂终浓度0、８％，每3０min取样一次

灭活甲醛终浓度0、０２％，灭活２~5天

超滤去除裂解剂灭活剂100KD

层析纯化—-

过滤原液—-