流式细胞仪培训手册(完成版)_图文

流式细胞仪培训手册

序论

学习仪器的最好方法是操作仪器,然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。本书介绍了流式细胞仪的基本知识,并从不同角度详尽阐述了各种台式机(FACScanTM , FACSortTM , FACSCaliburTM ,和 BD LSR与大型机(FACS VantageTM, FACSVantageTM SE, 和 FACStarPLUSTM 之间的不同。阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。

目录

第 1章综述…………………………………………………………………… 4 第 2章液流系统………………………………………………………………

第 3章散射光信号及荧光信号………………………………………………

3.1 散射光信号………………………………………………………

3.2 荧光信号…………………………………………………………

3.3 荧光补偿

第 4章光电系统………………………………………………………………

4.1 光平台……………………………………………………………

4.2 光学滤片………………………………………………………

4.3 信号探测器……………………………………………………

4.4 阈值………………………………………………………………

第 5章数据分析………………………………………………………………

5.1 数据采集及显示…………………………………………………

5.2 设门………………………………………………………………

5.3 细胞亚群的数据分析…………………………………………

5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析………………………………

5.5 CellQuest软件使用……………………………………………

5.6 MutiSet 软件使用………………………………………………

5.7 Simultest 软件使用……………………………………………

5.8 B27软件使用…………………………………………………

5.9 WinMDI软件使用…………………………………………

5.10 FACSPress软件使用…………………………………………

5.11 System II软件使用…………………………………………

5.12 MultiCycle软件使用…………………………………………

5.13 Modfit使件使用……………………………………………

第 6章流式基本检测项目

6.1淋巴细胞亚群检测 (双色、三色、四色,三种软件分析6.2 B27的检测………………………………………………………

6.3 血小板抗体检测………………………………………………

6.4 网织血小板及红细胞分析……………………………………

6.5 干细胞检测……………………………………………………

6.6 DNA倍体分析……………………………………………………

6.7 凋亡检测…………………………………………………………

第 7章分选

6.1 分选………………………………………………………………

第 8章激光器及光路校正……………………………………………………

7.1 激光器的工作原理………………………………………………

7.2 光路校正…………………………………………………………

第 9章答案………………………………………………………………

第一章综述

流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术,通常指细胞通过激光束时在液流中的特性,即粒子的大小,密度或是内部结构,以及相对的荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。流式细胞仪主要由三部分组成:流动室和液流系统;光路系统以及电系统。其作用如下:

·液流系统:依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。

·光路系统:细胞由激光激发,通过光学滤片产生光信号,并传送到相应的探测器。

·电系统:把光信号转换为电信号。对于有分选装置的仪器,电系统可初始化分选条件。

在流式细胞仪中,细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为 0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中,用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的,分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子

称为细胞液柱,当粒子经过激光照射区时,通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统(相应的透镜,滤片和探测器收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器,把光信号转换为电信号。

单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性,通过列表模式(List mode完成数据采集,并对样本中的细胞亚群进行分析。

图 1-1 散射光和激发光信号转换成为计算机可处理的充电脉冲

习题:概览

1 流式细胞仪可测量细胞或粒子的哪些属性?

2 大多数流式细胞仪使用何种光源?

3 流式细胞仪的三大系统是什么?

4 哪种类型的生物样本最适于做流式细胞分析?

5 液流包绕细胞形成 ?

6 带有荧光的细胞通过激光束时,会产生哪两种光信号?

7 由粒子激发的光由收集。 8 所有流式细胞测量是在单个细胞上同时进行吗?(对错

9 在进行流式分析之前粒子必须是单个细胞悬液吗?(对错

第二章液流系统

液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区,其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内, 应该只有一个细胞或粒子通过激光束。因此, 必须在流动室内把细胞注入鞘液流。流动室是液流系统的核心部件,台式机中流动室称为样品槽,大型机称之为喷嘴。在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心,细胞在此与激光相交。流动室内充满鞘液,根据层流原理,在鞘液的约束下,细胞排成单列出流动室喷嘴口,并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计,使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态,这个过程称为流体聚焦。该原理适用于所有流动室,如图 2-1和 2-2所示:

图 2-1 细胞液柱通过样品槽产生流体聚焦, 图 2-2 细胞液柱通过喷嘴产生流体聚焦样本压力和鞘液压力是不同的, 且样本压力总是大于鞘液压力。样本压力调节器通过改变样本压力的方法控制样本流速。

·台式机:单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出, 粒子或细胞在流动室内与激光相交 (图 2-1 。除 BD LSR型台式机有样本压力细调旋钮外,大多数台式机都采用固定的样本压力(分低,中,高速。

·大型机:单个细胞悬液从喷嘴喷出后,粒子或细胞在流动室外与激光相交(图 2-2。且样本压力连续可调。

增加样本压力就是通过加宽液柱的方法增加样本流速。换言之,在特定时间内,允许更多细胞通过液流。当液柱变宽时,一些流经激光束的细胞会偏离中心,光斑也会偏离理想角度,这在一定程度下是允许的。

·高流速适用于定性测量,如免疫表型。样本流变宽,细胞间距离缩短,这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加,可以快速获取数据。