免疫组化
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非特异性染色是免疫组织化学染色中常遇见的问 题，可以通过最大限度稀释抗体、滴加第一抗体前采用 牛血清白蛋白阻断或采用第二抗体同种属正常血清阻 断。 ４．３ 内源性过氧化物酶
内源性过氧化物酶可造成严重的背景染色，含有 内源性过氧化物酶的组织或细胞包括：脑、脾、中性白 细胞、巨噬细胞，血红蛋白和肌红蛋白。
抗原热修复方法包括：蛋白酶消化或热修复。蛋 白酶消化可采用如下几种方法：０ ． １ ％ 胃蛋白酶３ ０ 分 钟；０．０１％～０．１％胰蛋白酶１５分钟～２小时；０．００２ ５％ 链酶蛋白酶４～６分钟。一般说来蛋白酶消化适用范围 窄，抗原修复的效果也较差。
有些单克隆抗体，例如ＥＲＩＤ５Ｋｉ－６７ （ＭＩＢ１ ）， 如果不通过抗原热修复，不能在福马林固定石蜡包埋组 织中获得阳性免疫组织化学染色结果。抗原热修复是将
酶的影响，因为Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ 复合物中的碱性磷酸酶是从牛 小肠组织中提取的， 只存在于小肠组织，而底物中的 左旋咪唑可抑制非肠源性碱性磷酸酶，Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ 试剂稳 定性好，室温下１年不失活。 ２．３ ＡＢＣ法
ＡＢＣ法的基础是Ａｖｉｄｉｎ与Ｂｉｏｔｉｎ高亲合力结合， Ｂｉｏｔｉｎ标记的第二抗体可高度稀释，因为一个第二抗体 分子能形成１５０个Ｂｉｏｔｉｎ触手，ＡＢＣ复合物中一个Ａｖｉ－ ｄｉｎ分子结合３个酶标 Ｂｉｏｔｉｎ分子。两种试剂混合形成 Ａ Ｂ Ｃ复合物需要在滴加ＡＢＣ 复合物前３０ 分钟完成。 ２．４ ＬＳＡＢ法
Ｌ Ｓ Ａ Ｂ 法与ＡＢＣ 法基本相似，只是用辣根过氧化物 酶标记的链亲和素代替了Ａ Ｂ Ｃ复合物。ＬＳＡＢ 法与Ａ Ｂ Ｃ 法检测系统可能受内源性Ｂｉｏｔｉｎ的影响。
标记的葡聚糖聚合物法将抗体和辣根过氧化物酶分 子均标记于葡聚糖聚合物，可分为直接法和间接法，在目 前最敏感的免疫组化染色法。在所有以辣根过氧化物酶为 标记物的检测系统可能受内源性辣根过氧化物酶的影响。 ３ 抗体应用简述
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CONTINUING MEDICAL EDUCATION Vol.20.No.27
知识／技能篇
ＨＲＰ标记二抗
ＨＲＰ标记一抗
ＰＡＰ 复合物
第一抗体
桥抗体
第一抗体 抗原
直接法
间接法
ＰＡＰ 法
图 １ 直接法、间接法和ＰＡＰ 法免疫组化示意图
ＡＢ 复合物
酶标链卵白素
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｉｏｔｉｎ
免疫组织化学染色阳性信号的位置必须与被检测抗 原在细胞及亚细胞结构的定位相一致。免疫组织化学中
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知识／技能篇
常见的抗原表达模式有以下几种。 ５．２．１ 细胞浆的阳性反应：根据抗原亚细胞结构定位的 不同，有数种表现形式。一些中间丝蛋白，如细胞角蛋 白（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ，ＣＫ）和波形蛋白（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）等主 要呈胞浆内纤维状染色，少数神经内分泌肿瘤可呈胞浆 内包含体样点状染色；ＣＤ１５和ＣＤ３０等抗原染色呈胞浆 内局限性点状阳性反应；ＢＣＬ２蛋白定位于线粒体，常 表现为细胞浆内弥漫性阳性反应。 ５．２．２ 细胞膜线性阳性反应：ＬＣＡ、ＣＤ２０、ＣＤ５等大 多数淋巴细胞分化抗原定位于细胞膜；细胞表面受体， 例如表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）、血小板源性生长因 子受体（ＰＤＧＦＲ ）、Ｃ Ｄ １ １ ７ 、ｃ － ｅ ｒ ｂ Ｂ － ２ ／ Ｈ ｅ ｒ － ２ ／ ｎ ｅ ｕ 等；细胞黏附分子，如Ｃ Ｄ ３ １ 、Ｃ Ｄ ５ ６ 、上皮钙粘素 （Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）等。 ５．２．３ 细胞核阳性反应：转录因子如甲状腺转录因子 （Ｔ Ｔ Ｆ － １ ）、ｆｏｓ 、ｊｕｎ 、ｍｙｃ 、Ｃ Ｄ Ｘ ２ 、Ｍ ｙ ｏ Ｄ １ 等；细 胞周期调控蛋白，如细胞周期素（Ｃｙｃｌｉｎｓ）、细胞周 期素依赖性激酶（ＣＤＫｓ）和细胞周期素依赖性激酶抑 制因子（ＣＤＫＩｓ，例如ｐ １ ６）；类固醇激素受体ＥＲ 、 Ａ Ｒ 和Ｐ Ｒ 等；抑癌基因产物，例如ｐ ５ ３ 、ｐ ６ ３ 、Ｒ ｂ 、 Ｗ Ｔ １等；错配修复基因产物，例如Ｍ Ｌ Ｈ １ 、Ｍ Ｓ Ｈ ２ 等； 以及细胞增殖相关蛋白ＰＣＮＡ和Ｋｉ－６７ 等。有的抗体可 同时出现细胞浆和细胞膜的阳性表达，如Ｅ Ｍ Ａ可呈膜 性和胞浆内弥漫性阳性反应。有的抗体可同时出现细胞 浆和细胞核的阳性表达，如Ｓ１００。
影响免疫组织化学染色的因素主要包括：组织固 定方法；免疫组化染色方法的敏感性；抗体的特性。由 于福马林固定所引起的抗原决定基掩盖的问题基本可通 过蛋白酶或抗原热修复途径得到解决。目前日益进步的 免疫组化染色方法已经大大地提高了免疫组化染色的敏 感性。选择适宜的抗体、采用合适的稀释度是提高免疫 组化染色敏感性的主要途径，例如ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１鼠单抗远 不及兔单抗好用，某些ＣＤ１１７抗体可与未知的核抗原发 生交叉反应。 ５．２ 注意区别噪音和信号
抗体有两大类，一类是单克隆抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ ），另一类是多克隆抗体（Ｐ ｏ ｌ ｙ ｃ ｌ ｏ ｎ ａ ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）。传统的单克隆抗体来自于鼠杂交瘤，具有 较高的特异性，但敏感性较多克隆抗体差，最近又出现 了不少兔单克隆抗体，至少一部分兔单克隆抗体对人体 抗原显示出更为良好的亲合性。多克隆抗体具有较高的 敏感性，但特异性相对较差，不同批号的多克隆抗体品 质可能有较大差别。将针对同一抗原的多种单克隆抗体 勾兑在一起形成的鸡尾酒式单克隆抗体，又称多克隆性 单克隆抗体（例如ＡＥ１／ＡＥ３抗角蛋白抗体），兼有单克 隆抗体的特异性和多克隆抗体的敏感性。在免疫组织化 学染色中ＩｇＧ类单克隆抗体常常优于ＩｇＭ类单克隆抗体。
切片置于缓冲液中加热，以达到修复抗原性的目的。常 用的抗原热修复方法有微波炉法和高压锅法。影响抗原 热修复效果的因素包括：热修复的温度和时间；缓冲液 的种类和ｐＨ值。常用的抗原热修复缓冲液包括：０．０１Ｍ 枸橼酸钠缓冲液，ｐＨ６．０（无毒，方便，适用于多种抗 原）；０ ． ３ Ｍ氯化铝（适用于中间丝蛋白、Ｃ Ｄ ２ ９ ， ＣＤ５４等）；０．０１ Ｍ碳酸钠（适用于诸如Ｂｏｕｉｎ固定液 等酸性固定液）；４ ～６ Ｍ 尿素；０ ． １ ％ Ｓ Ｄ Ｓ ；Ｅ Ｄ Ｔ Ａ （ｐＨ８．０）。高压锅法修复抗原切片在金属架上放置不 宜太密，一般抗原修复效果优于微波炉法。 ５ 影响免疫组织化学染色的因素和结果解释 ５．１ 影响免疫组织化学染色的因素
检测系统 辣根过氧化物酶 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶
表１ 免疫酶技术中常用的几种标记酶及其底物
底物
产物颜色
Ｄห้องสมุดไป่ตู้Ｂ
棕色
ＡＥＣ
红色
ＮＢＴ／ＢＣＩＰ
深蓝色
坚牢红
红色
坚牢兰
蓝色
封片 中性树胶 甘油 中性树胶
２ 免疫组织化学染色方法 用荧光分子、金属原子、酶分子为示踪剂的免疫
组织化学染色方法均可采用直接法或间接法。直接法是 用示踪剂标记第一抗体，而间接法是用示踪剂标记第二 抗体。此外还有辣根过氧化物酶抗辣根过氧化物酶 （Ｐ Ａ Ｐ ）法、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ ） 法、亲合素－生物素－辣根过氧化物酶复合物（ＡＢＣ） 法、链亲和素－生物素（Ｌ Ｓ Ａ Ｂ）法、标记的葡聚糖聚
病理诊断的根本目的在于更好地为临床疾病诊 断、预后判断、认识疾病的发生机制，以及指导疾病临 床治疗方案的选择服务。免疫组化技术作为病理诊断的 辅助技术，已经成为目前临床组织病理断不可或缺的必 要手段之一，免疫组化技术的应用大大提高了病理诊断 的水平。 １ 免疫组织化学的定义 免疫组织化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）是利用 抗体与抗原的特异性结合反应来鉴定组织或细胞中特 定化学物质的一种组织化学方法，是免疫学和传统的 组织化学的结合。免疫组织化学染色技术是一种从分 子水平辅助诊断的技术，具有较高的敏感性和特异 性，可在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上进行 蛋白质或多肽类物质的定位，免疫电镜技术（例如免 疫胶体金技术）甚至可在亚细胞结构水平进行蛋白质
合物（ＬＤＰ，又称Ｅｎｖｉｓｉｏｎ，或Ｅ Ｐ Ｏ Ｓ）法，参见图 １、图２、图３。
这里仅对Ｐ Ａ Ｐ 法、Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ 法、Ａ Ｂ Ｃ 法、Ｌ Ｓ Ａ Ｂ 法 和Ｅｎｖｉｓｉｏｎ法作简单介绍。 ２．１ ＰＡＰ法是用桥抗体将第一抗体与ＰＡＰ复合物连接起 来，ＰＡＰ复合物由两个抗体分子和三个辣根过氧化物酶 分子构成，第一抗体与ＰＡＰ复合物应来源同一种属。 ２．２ ＡＰＡＡＰ法
在免疫组织化学染色前用于消除内源性过氧化物酶 活性的常用试剂和方法有：３ ％ Ｈ２Ｏ ２，５ 分钟；０．３％Ｈ２ Ｏ ２ 甲醇溶液，１５分钟；０．１％ＨＣｌ酒精溶液，３０分钟；０．２％ 醋酸甲醇溶液，３０分钟；０．０１％ 过碘酸 ５～１０分钟， 然后０．１％硼酸钠１０分钟。 ４．４ 内源性生物素
冰冻组织切片存在内源性生物素，热抗原修复的 福尔马林固定石蜡切片可使内源性生物素复活，特别是 腺上皮组织。内源性生物素活性可被２０％的生蛋清或 Ａｖｉｄｉｎ封闭。为了规避内源性生物素活性的干扰还可采 用非生物素检测系统，如Ｅｎｖｉｓｉｏｎ法或ＡＰＡＡＰ法。为 避免将内源性生物素产生噪音误解为阳性信号，应坚持 使用阴性对照。 ４．５ 抗原性修复
Ａｙｉｄｉｎ
生物素化Ⅱ抗 Ⅰ抗
组织抗原 ＡＢＣ 法（３ 步完成） ＬｓＡＢ（ＳＰ）法（３步完成）
图 ２ ＡＢＣ 法和 ＬＳＡＢ 法免疫组化示意图
辣根过氧化物酶
第二抗体 第一抗体 抗原
葡聚糖
图３ Ｅｎｉｓｉｏｎ法免疫组化示意图
Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ法与ＰＡＰ 法基本相似，是用桥抗体将第一 抗体与Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ复合物连接起来，ＡＰＡＡＰ复合物由两个 抗体分子和两个碱性磷酸酶分子构成。Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ 法不受 内源性辣根过氧化物酶的影响，也不受内源性碱性磷酸
抗体原液一般应分装－２０℃保存于硅化管中。即用 型抗体一般要求４℃～８℃保存，应注意有效期。要特别 注意防止抗体的相互交叉污染或被细菌污染。
４ 免疫组织化学染色常见问题的解决 ４．１ 组织固定
继续医学教育 第 ２０ 卷第 ２７ 期
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知识／技能篇
组织固定严重影响着免疫组织化学染色结果，常 用的固定液包括醛类蛋白交联剂，或为醇类和酮类蛋白 沉淀剂。供免疫组织化学染色的组织应及时和良好固 定，或为新鲜组织。新鲜组织应及时固定于１０％的中性 福马林中，固定液至少为标本体积的４～５倍，也应注意 防止过固定。固定不及时或固定不良会造成抗原性丢失 或扩散，过分固定会掩盖抗原决定基。 ４．２ 非特异性染色
知识／技能篇
免疫组化——病理诊断的重要的检查
Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ａｎ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｅｘａｍｉｎｅ ｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ
郑杰（北京大学医学部病理学系 １ ０ ０ ０ ８ ３ ） ＺＨＥＮＧ Ｊｉｅ
郑杰，男， 主任医师， 教授，博士生导师。研 究方向：诊断病理学和 肿 瘤 基 础 研 究 。社会 任职：中华医学会病理 学 分 会 常 委 ，《中华病 理学》杂志副主编，中 国病理科主任联合会 副 主 席 ，国 际 病 理 学 会 中 国 分 支 秘 书 ，北 京实验动物学会副理 事长。
除了前文已经提到的内源性过氧化物酶活性和内 源性生物素对免疫组织化学染色结果的影响外，还有一 些因素影响着免疫组织化学染色结果，容易使人将噪音 误解为信号。例如坏死组织或被挤压的组织可以出现假 阳性；不应将边缘效应误解为阳性信号；某些多核巨细 胞可有浅淡的背景染色；不应将肿瘤组织中残留的正常 组织的免疫组织化学信号误认为是肿瘤的染色反应；如 果肿瘤破坏了周围正常组织，被破坏的正常细胞胞浆内 的可溶性蛋白可以释放，这些蛋白或坏死组织碎片被肿 瘤细胞吸附或吞噬，使瘤细胞出现该种抗原的阳性反 应，或被巨噬细胞吞噬造成使人迷惑的假象（例如胃溃 疡边缘的固有膜内出现角蛋白阳性的巨噬细胞，易被误 诊胃印戒细胞癌）。
或多肽类物质的定位。 免疫组织化学技术涉及第一抗体与抗原的特异性
结合、示踪剂（例如荧光分子、金属原子、酶分子 等）标记第一或第二抗体。以荧光分子为示踪剂的免 疫组织化学技术称为免疫荧光技术，观察需使用荧光 显微镜，采用的荧光素主要为Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ （异硫氰酸荧光 黄，最大吸收光谱为４９０～４９５ ｎｍ，最大发射光谱为 ５２０ ～５３０ ｎｍ ）和四甲基异硫氰酸罗丹明（Ｔ Ｒ Ｉ Ｔ Ｃ ， 最大吸收光谱为５５０ ｎｍ，最大发射光谱为６２０ ｎｍ）； 以金属原子为示踪剂的免疫组织化学技术观察时常常 需使用电子显微镜，称为免疫电镜技术；以酶分子为 示踪剂的免疫组织化学技术称为免疫酶技术，需要通 过酶分子催化底物分子产生有色的沉淀物，才能在光 学显微镜下观察到，用于免疫组织化学标记的酶分子 主要为辣根过氧化物酶（Ｈ Ｒ Ｐ）和碱性磷酸酶，它们 的相应底物、产物颜色和封片剂见表１。
内源性过氧化物酶可造成严重的背景染色，含有 内源性过氧化物酶的组织或细胞包括：脑、脾、中性白 细胞、巨噬细胞，血红蛋白和肌红蛋白。
抗原热修复方法包括：蛋白酶消化或热修复。蛋 白酶消化可采用如下几种方法：０ ． １ ％ 胃蛋白酶３ ０ 分 钟；０．０１％～０．１％胰蛋白酶１５分钟～２小时；０．００２ ５％ 链酶蛋白酶４～６分钟。一般说来蛋白酶消化适用范围 窄，抗原修复的效果也较差。
有些单克隆抗体，例如ＥＲＩＤ５Ｋｉ－６７ （ＭＩＢ１ ）， 如果不通过抗原热修复，不能在福马林固定石蜡包埋组 织中获得阳性免疫组织化学染色结果。抗原热修复是将
酶的影响，因为Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ 复合物中的碱性磷酸酶是从牛 小肠组织中提取的， 只存在于小肠组织，而底物中的 左旋咪唑可抑制非肠源性碱性磷酸酶，Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ 试剂稳 定性好，室温下１年不失活。 ２．３ ＡＢＣ法
ＡＢＣ法的基础是Ａｖｉｄｉｎ与Ｂｉｏｔｉｎ高亲合力结合， Ｂｉｏｔｉｎ标记的第二抗体可高度稀释，因为一个第二抗体 分子能形成１５０个Ｂｉｏｔｉｎ触手，ＡＢＣ复合物中一个Ａｖｉ－ ｄｉｎ分子结合３个酶标 Ｂｉｏｔｉｎ分子。两种试剂混合形成 Ａ Ｂ Ｃ复合物需要在滴加ＡＢＣ 复合物前３０ 分钟完成。 ２．４ ＬＳＡＢ法
Ｌ Ｓ Ａ Ｂ 法与ＡＢＣ 法基本相似，只是用辣根过氧化物 酶标记的链亲和素代替了Ａ Ｂ Ｃ复合物。ＬＳＡＢ 法与Ａ Ｂ Ｃ 法检测系统可能受内源性Ｂｉｏｔｉｎ的影响。
标记的葡聚糖聚合物法将抗体和辣根过氧化物酶分 子均标记于葡聚糖聚合物，可分为直接法和间接法，在目 前最敏感的免疫组化染色法。在所有以辣根过氧化物酶为 标记物的检测系统可能受内源性辣根过氧化物酶的影响。 ３ 抗体应用简述
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ＨＲＰ标记二抗
ＨＲＰ标记一抗
ＰＡＰ 复合物
第一抗体
桥抗体
第一抗体 抗原
直接法
间接法
ＰＡＰ 法
图 １ 直接法、间接法和ＰＡＰ 法免疫组化示意图
ＡＢ 复合物
酶标链卵白素
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｉｏｔｉｎ
免疫组织化学染色阳性信号的位置必须与被检测抗 原在细胞及亚细胞结构的定位相一致。免疫组织化学中
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常见的抗原表达模式有以下几种。 ５．２．１ 细胞浆的阳性反应：根据抗原亚细胞结构定位的 不同，有数种表现形式。一些中间丝蛋白，如细胞角蛋 白（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ，ＣＫ）和波形蛋白（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）等主 要呈胞浆内纤维状染色，少数神经内分泌肿瘤可呈胞浆 内包含体样点状染色；ＣＤ１５和ＣＤ３０等抗原染色呈胞浆 内局限性点状阳性反应；ＢＣＬ２蛋白定位于线粒体，常 表现为细胞浆内弥漫性阳性反应。 ５．２．２ 细胞膜线性阳性反应：ＬＣＡ、ＣＤ２０、ＣＤ５等大 多数淋巴细胞分化抗原定位于细胞膜；细胞表面受体， 例如表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）、血小板源性生长因 子受体（ＰＤＧＦＲ ）、Ｃ Ｄ １ １ ７ 、ｃ － ｅ ｒ ｂ Ｂ － ２ ／ Ｈ ｅ ｒ － ２ ／ ｎ ｅ ｕ 等；细胞黏附分子，如Ｃ Ｄ ３ １ 、Ｃ Ｄ ５ ６ 、上皮钙粘素 （Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）等。 ５．２．３ 细胞核阳性反应：转录因子如甲状腺转录因子 （Ｔ Ｔ Ｆ － １ ）、ｆｏｓ 、ｊｕｎ 、ｍｙｃ 、Ｃ Ｄ Ｘ ２ 、Ｍ ｙ ｏ Ｄ １ 等；细 胞周期调控蛋白，如细胞周期素（Ｃｙｃｌｉｎｓ）、细胞周 期素依赖性激酶（ＣＤＫｓ）和细胞周期素依赖性激酶抑 制因子（ＣＤＫＩｓ，例如ｐ １ ６）；类固醇激素受体ＥＲ 、 Ａ Ｒ 和Ｐ Ｒ 等；抑癌基因产物，例如ｐ ５ ３ 、ｐ ６ ３ 、Ｒ ｂ 、 Ｗ Ｔ １等；错配修复基因产物，例如Ｍ Ｌ Ｈ １ 、Ｍ Ｓ Ｈ ２ 等； 以及细胞增殖相关蛋白ＰＣＮＡ和Ｋｉ－６７ 等。有的抗体可 同时出现细胞浆和细胞膜的阳性表达，如Ｅ Ｍ Ａ可呈膜 性和胞浆内弥漫性阳性反应。有的抗体可同时出现细胞 浆和细胞核的阳性表达，如Ｓ１００。
影响免疫组织化学染色的因素主要包括：组织固 定方法；免疫组化染色方法的敏感性；抗体的特性。由 于福马林固定所引起的抗原决定基掩盖的问题基本可通 过蛋白酶或抗原热修复途径得到解决。目前日益进步的 免疫组化染色方法已经大大地提高了免疫组化染色的敏 感性。选择适宜的抗体、采用合适的稀释度是提高免疫 组化染色敏感性的主要途径，例如ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１鼠单抗远 不及兔单抗好用，某些ＣＤ１１７抗体可与未知的核抗原发 生交叉反应。 ５．２ 注意区别噪音和信号
抗体有两大类，一类是单克隆抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ ），另一类是多克隆抗体（Ｐ ｏ ｌ ｙ ｃ ｌ ｏ ｎ ａ ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）。传统的单克隆抗体来自于鼠杂交瘤，具有 较高的特异性，但敏感性较多克隆抗体差，最近又出现 了不少兔单克隆抗体，至少一部分兔单克隆抗体对人体 抗原显示出更为良好的亲合性。多克隆抗体具有较高的 敏感性，但特异性相对较差，不同批号的多克隆抗体品 质可能有较大差别。将针对同一抗原的多种单克隆抗体 勾兑在一起形成的鸡尾酒式单克隆抗体，又称多克隆性 单克隆抗体（例如ＡＥ１／ＡＥ３抗角蛋白抗体），兼有单克 隆抗体的特异性和多克隆抗体的敏感性。在免疫组织化 学染色中ＩｇＧ类单克隆抗体常常优于ＩｇＭ类单克隆抗体。
切片置于缓冲液中加热，以达到修复抗原性的目的。常 用的抗原热修复方法有微波炉法和高压锅法。影响抗原 热修复效果的因素包括：热修复的温度和时间；缓冲液 的种类和ｐＨ值。常用的抗原热修复缓冲液包括：０．０１Ｍ 枸橼酸钠缓冲液，ｐＨ６．０（无毒，方便，适用于多种抗 原）；０ ． ３ Ｍ氯化铝（适用于中间丝蛋白、Ｃ Ｄ ２ ９ ， ＣＤ５４等）；０．０１ Ｍ碳酸钠（适用于诸如Ｂｏｕｉｎ固定液 等酸性固定液）；４ ～６ Ｍ 尿素；０ ． １ ％ Ｓ Ｄ Ｓ ；Ｅ Ｄ Ｔ Ａ （ｐＨ８．０）。高压锅法修复抗原切片在金属架上放置不 宜太密，一般抗原修复效果优于微波炉法。 ５ 影响免疫组织化学染色的因素和结果解释 ５．１ 影响免疫组织化学染色的因素
检测系统 辣根过氧化物酶 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶
表１ 免疫酶技术中常用的几种标记酶及其底物
底物
产物颜色
Ｄห้องสมุดไป่ตู้Ｂ
棕色
ＡＥＣ
红色
ＮＢＴ／ＢＣＩＰ
深蓝色
坚牢红
红色
坚牢兰
蓝色
封片 中性树胶 甘油 中性树胶
２ 免疫组织化学染色方法 用荧光分子、金属原子、酶分子为示踪剂的免疫
组织化学染色方法均可采用直接法或间接法。直接法是 用示踪剂标记第一抗体，而间接法是用示踪剂标记第二 抗体。此外还有辣根过氧化物酶抗辣根过氧化物酶 （Ｐ Ａ Ｐ ）法、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ ） 法、亲合素－生物素－辣根过氧化物酶复合物（ＡＢＣ） 法、链亲和素－生物素（Ｌ Ｓ Ａ Ｂ）法、标记的葡聚糖聚
病理诊断的根本目的在于更好地为临床疾病诊 断、预后判断、认识疾病的发生机制，以及指导疾病临 床治疗方案的选择服务。免疫组化技术作为病理诊断的 辅助技术，已经成为目前临床组织病理断不可或缺的必 要手段之一，免疫组化技术的应用大大提高了病理诊断 的水平。 １ 免疫组织化学的定义 免疫组织化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）是利用 抗体与抗原的特异性结合反应来鉴定组织或细胞中特 定化学物质的一种组织化学方法，是免疫学和传统的 组织化学的结合。免疫组织化学染色技术是一种从分 子水平辅助诊断的技术，具有较高的敏感性和特异 性，可在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上进行 蛋白质或多肽类物质的定位，免疫电镜技术（例如免 疫胶体金技术）甚至可在亚细胞结构水平进行蛋白质
合物（ＬＤＰ，又称Ｅｎｖｉｓｉｏｎ，或Ｅ Ｐ Ｏ Ｓ）法，参见图 １、图２、图３。
这里仅对Ｐ Ａ Ｐ 法、Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ 法、Ａ Ｂ Ｃ 法、Ｌ Ｓ Ａ Ｂ 法 和Ｅｎｖｉｓｉｏｎ法作简单介绍。 ２．１ ＰＡＰ法是用桥抗体将第一抗体与ＰＡＰ复合物连接起 来，ＰＡＰ复合物由两个抗体分子和三个辣根过氧化物酶 分子构成，第一抗体与ＰＡＰ复合物应来源同一种属。 ２．２ ＡＰＡＡＰ法
在免疫组织化学染色前用于消除内源性过氧化物酶 活性的常用试剂和方法有：３ ％ Ｈ２Ｏ ２，５ 分钟；０．３％Ｈ２ Ｏ ２ 甲醇溶液，１５分钟；０．１％ＨＣｌ酒精溶液，３０分钟；０．２％ 醋酸甲醇溶液，３０分钟；０．０１％ 过碘酸 ５～１０分钟， 然后０．１％硼酸钠１０分钟。 ４．４ 内源性生物素
冰冻组织切片存在内源性生物素，热抗原修复的 福尔马林固定石蜡切片可使内源性生物素复活，特别是 腺上皮组织。内源性生物素活性可被２０％的生蛋清或 Ａｖｉｄｉｎ封闭。为了规避内源性生物素活性的干扰还可采 用非生物素检测系统，如Ｅｎｖｉｓｉｏｎ法或ＡＰＡＡＰ法。为 避免将内源性生物素产生噪音误解为阳性信号，应坚持 使用阴性对照。 ４．５ 抗原性修复
Ａｙｉｄｉｎ
生物素化Ⅱ抗 Ⅰ抗
组织抗原 ＡＢＣ 法（３ 步完成） ＬｓＡＢ（ＳＰ）法（３步完成）
图 ２ ＡＢＣ 法和 ＬＳＡＢ 法免疫组化示意图
辣根过氧化物酶
第二抗体 第一抗体 抗原
葡聚糖
图３ Ｅｎｉｓｉｏｎ法免疫组化示意图
Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ法与ＰＡＰ 法基本相似，是用桥抗体将第一 抗体与Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ复合物连接起来，ＡＰＡＡＰ复合物由两个 抗体分子和两个碱性磷酸酶分子构成。Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ 法不受 内源性辣根过氧化物酶的影响，也不受内源性碱性磷酸
抗体原液一般应分装－２０℃保存于硅化管中。即用 型抗体一般要求４℃～８℃保存，应注意有效期。要特别 注意防止抗体的相互交叉污染或被细菌污染。
４ 免疫组织化学染色常见问题的解决 ４．１ 组织固定
继续医学教育 第 ２０ 卷第 ２７ 期
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组织固定严重影响着免疫组织化学染色结果，常 用的固定液包括醛类蛋白交联剂，或为醇类和酮类蛋白 沉淀剂。供免疫组织化学染色的组织应及时和良好固 定，或为新鲜组织。新鲜组织应及时固定于１０％的中性 福马林中，固定液至少为标本体积的４～５倍，也应注意 防止过固定。固定不及时或固定不良会造成抗原性丢失 或扩散，过分固定会掩盖抗原决定基。 ４．２ 非特异性染色
知识／技能篇
免疫组化——病理诊断的重要的检查
Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ａｎ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｅｘａｍｉｎｅ ｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ
郑杰（北京大学医学部病理学系 １ ０ ０ ０ ８ ３ ） ＺＨＥＮＧ Ｊｉｅ
郑杰，男， 主任医师， 教授，博士生导师。研 究方向：诊断病理学和 肿 瘤 基 础 研 究 。社会 任职：中华医学会病理 学 分 会 常 委 ，《中华病 理学》杂志副主编，中 国病理科主任联合会 副 主 席 ，国 际 病 理 学 会 中 国 分 支 秘 书 ，北 京实验动物学会副理 事长。
除了前文已经提到的内源性过氧化物酶活性和内 源性生物素对免疫组织化学染色结果的影响外，还有一 些因素影响着免疫组织化学染色结果，容易使人将噪音 误解为信号。例如坏死组织或被挤压的组织可以出现假 阳性；不应将边缘效应误解为阳性信号；某些多核巨细 胞可有浅淡的背景染色；不应将肿瘤组织中残留的正常 组织的免疫组织化学信号误认为是肿瘤的染色反应；如 果肿瘤破坏了周围正常组织，被破坏的正常细胞胞浆内 的可溶性蛋白可以释放，这些蛋白或坏死组织碎片被肿 瘤细胞吸附或吞噬，使瘤细胞出现该种抗原的阳性反 应，或被巨噬细胞吞噬造成使人迷惑的假象（例如胃溃 疡边缘的固有膜内出现角蛋白阳性的巨噬细胞，易被误 诊胃印戒细胞癌）。
或多肽类物质的定位。 免疫组织化学技术涉及第一抗体与抗原的特异性
结合、示踪剂（例如荧光分子、金属原子、酶分子 等）标记第一或第二抗体。以荧光分子为示踪剂的免 疫组织化学技术称为免疫荧光技术，观察需使用荧光 显微镜，采用的荧光素主要为Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ （异硫氰酸荧光 黄，最大吸收光谱为４９０～４９５ ｎｍ，最大发射光谱为 ５２０ ～５３０ ｎｍ ）和四甲基异硫氰酸罗丹明（Ｔ Ｒ Ｉ Ｔ Ｃ ， 最大吸收光谱为５５０ ｎｍ，最大发射光谱为６２０ ｎｍ）； 以金属原子为示踪剂的免疫组织化学技术观察时常常 需使用电子显微镜，称为免疫电镜技术；以酶分子为 示踪剂的免疫组织化学技术称为免疫酶技术，需要通 过酶分子催化底物分子产生有色的沉淀物，才能在光 学显微镜下观察到，用于免疫组织化学标记的酶分子 主要为辣根过氧化物酶（Ｈ Ｒ Ｐ）和碱性磷酸酶，它们 的相应底物、产物颜色和封片剂见表１。