【微生物工程】第八章_基因工程菌的培养

提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
固定化 固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性 基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的 表达率都有了很大提高。 在游离重组菌系统中常用抗生素，氨基酸等选择性压力稳定质 粒的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法 后，这种选择压力则可被省去。 不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。
基因工程菌培养方式
连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程
度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。 连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研
究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等 创造了良好的条件。
但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。 在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优 化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获 得最高表达水平或最大产率。
基因工程菌的稳定性
重组质粒逃逸的原因有： 高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料促使重 组质粒渗漏 受体细胞中的核酸酶降解重组质粒 重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒拷贝 数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧
基因工程菌的稳定性
影响基因工程菌稳定性的因素
载体的选择
遗传特性
宿主的选择 外源基因是否整合到宿主染色体上
发酵工艺
培养基 生长速率 限制性基质 温度 pH 和溶氧 外源基因表达
基因工程菌的稳定性
提高基因工程菌稳定性的策略
改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法有：
将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
分阶段控制培养 因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制 在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问 题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表 达。
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
优化基因工程菌的培养工艺 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
第八章 基因工程菌的培养
基因工程菌的遗传不稳定性及其对策
基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 改善基因工程菌不稳定性的策略
பைடு நூலகம்
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的表现
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种 不稳定性具有下列两种表现形式：
结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表 观生物学功能的丧失
发酵罐体 保证高传质作用的搅拌器、 精细的温度控制和灭菌系统、 空气无菌过滤装置 残留气体处理装置 参数测量与控制系统（如 pH、O2、CO2 等） 培养液配制及连续操作装置等。
基因工程菌的培养设备
基因工程菌在发酵培养过程中要求 环境条件恒定，不影响其遗传特性，更不能引起所带质粒丢失。
对发酵罐有特殊要求 如要提供菌体生长的最适条件 培养过程不得污染 保证纯菌培养 培养及消毒过程中不得游离出异物，干扰细菌代谢活动
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢
能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生 应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排
分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸（curing）
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢
能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生 应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排
基因工程菌的培养
一、基因工程菌的培养方式 二、基因工程菌的发酵工艺
基因工程菌培养方式
基因工程菌发酵的基本操作方式有：
分批培养 分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限
半连续培养（补料分批） 在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的 生长，或得到更多的代谢产物
连续培养 不断地流加营养，并不断地取出发酵液。 连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。
固定化培养
基因工程菌培养方式
补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，
间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。 在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生
长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来， 根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。
基因工程菌的培养方式
固定化培养 基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化
技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提 高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。由于这一优点，基 因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。
基因工程菌的培养设备
发酵罐的组成部分有：