新生BALB／c小鼠大脑皮质神经元细胞培养方法的建立

新生 Ｂ Ｌ ／ 小 鼠大脑皮质神经元细胞培养方法的建立 Ａ Ｂｃ
辛 岗， 苏芸 ， 王革 非 ， 燕璇 ， 许 李康 生
汕 头 大 学 医学 院微 生 物 与免 疫 学教研 室 ， 东省 免 疫 病 理 重 点 实验 室 ， 东 汕 头 ５ ５ ４ 广 广 １０ １
［ 要 】 目的 ： 改 良和优 化 ， 立高 纯 度 Ｂ Ｌ ／ 摘 经 建 Ａ Ｂ ｃ小 鼠 大脑 皮 质 神 经 元培 养 的 方 法 。 法 ： 方 采用 Ｌ 多聚 赖氨 酸 包 被 一 细胞培养板， 新 生 Ｂ Ｌ ／ 取 Ａ Ｂ ｃ小 鼠（ 生 ２ 内） 脑 皮 质 组 织 ， Ｏ２ ％胰 酶 消 化 后 吹 打成 单个 细胞 ， ｌ １６孔 出 ４ｈ 大 经 ．５ 按 ｘ ０／
ｍｉ ．Ｍ ｅ ｏ ｓ ｈ ｏ ｅ ｅ ｆ ｍ ｎ ｗ ｏ （ ｓ ｈ ｎ ２ １ Ｂ Ｌ ／ ｉ ｅ ｂａ ｅ ｎ ｉｅｔ ｙ ０２ ％ ｃ ｅ ｔ ｄ ：Ｔ ｅ ｃｒ ｘ ｓ ｒ ｅ ｂ ｒ １ ｓ ｔａ ４ ｈ Ａ Ｂ ｃ ｍ ｃ ｗ ｒ ｏ ｔ ｎ ｄ ａ ｄ ｄｇ ｓ ｄ ｂ ． ｈ ｔ ｏ ｎ ｅ ｅ ｅ ｉ ｅ ５
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接 种 于 ３ ５ｍｍ 的 六孔 板 中 ， 神 经 元 细胞 培 养种 植 液 培 养 ６ｈ后 换 神 经 元 细胞 培 养 饲 养 液 ， 养 ４ 用 培 ０ ｈ时加 入 阿 糖 胞 苷 抑制 神 经 胶 质 细胞 的 生长 ， 时 观 察神 经 元 培养 情况 。 果 ： 养 ５ｄ的 神经 元 细胞 形 态 最 为典 型 ； 免疫 荧 光 随 结 培 经 方 法 鉴定 ， 经元 细 胞 纯度 为 ９ ％。结 论 ： 方法 改 良与优 化 ， 神 ３ 经 获得 了高 纯度 的原 代 培 养 小 鼠大 脑 皮质 神 经 元 细胞 。
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８ ６
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生 长纯度 。
０２ ％胰酶 （ ０ ２ Ｅ Ｔ 购 自 Ｇｂ ｏ公 司 ； 牛 ． ５ 含 ． ％ Ｄ Ａ） ０ ｉｃ 胎 血清 （ Ｂ ） 自杭州 四季青公 司 。 ＦＳ购 神 经元鉴定 中所 需试 剂兔抗 神经 元特 异 Ｂ １ 微 １ Ｉ
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技术 方 法
改 良和优 化 ， 建立 了一种 高密 度 、 高纯 度 的 Ｂ Ｌ ／ ＡＢｃ 小 鼠大脑皮 质神经 元细胞 的培养 方法 。
ｌ ［ 稿 日期 ］２ ０ ０ —１ 收 ０１ — ６ ［ 金 项 目 ］国 家 自然 科 学 基 金 （０ ７ ９ ８ ； 东 省 医学 科研 基 金 基 ３ ７ １８ ） 广 （ ２ １３ ２ ； 头 市 科技 计 划 项 目（ Ａ ００ ９ ）汕 汕府 科 ［０ ９７ ２ ０１０号 ） ［ 者 简 介 】 辛 岗 （９ ３ ）女 ， 士 ， 作 １７ 一 ， 硕 副教 授 ［ 信 作 者 】李 康生 ，Ｅ ｍ ｉ ｋｌ ｔ． ｕａ 通 （ — ａｌ ｓ ＠ｓ ｅ ． ） ｉ ｕｄ ｎ
ｗ ｉｈ ｗａ ｏ ｔ ｄ ｂ ｏｙ Ｌ ｌｓｎ ｖ ｒ ｉｈ ｒ ｖｏ ｓ ． Ａ ｔｒ ｃ ｌ ｖ ｔ ｄ ｉ ｅ ｄ ｎ ｄ ｕ ｆ ｒ ６ ｈ ｔ ｅ ｎ ｕ ｏ ｈ ｃ ｓ ｃ ａ ｅ ｙ ｐ ｌ — — ｙ ｉ ｅ ｏ ｅ ｇ ｔ ｐ ｅ ｉｕ ｌ ｎ ｙ ｆ ｕ ｔ ａ ｅ ｎ ｓ ｅ ｉｇ ｍｅ ｉｍ ． ｈ ｅ ｒ ｎ ｅ ｉ ｏ ｃ ｌ ｅｅ ｃ ｌ ｒｄ ｎ ｎ ｕｏ ａ ａ ｅｌ ｗ ｒ ｕ ｔ ｅ ｉ ｅ ｒ ｂ ｓ ｍｅ ｉｍ ｃ ｎａｎ ｎ ２ ， Ｆ Ｓ ａ ｄ ｇ ｕ ａ ｎ ． Ｃ ｔｓｎ ｒ ｂ ｎ ｆ ｒ ｎ ｓｄ ａ ｓ ｕ ｌ ｄｕ ｏ ｔｉ ｉ ｇ Ｂ ７ Ｂ ， ｎ ｌ ｔｍｉ ｅ ｙ ｏ ｉｅ ａ ａ ｉｏｕ ａ ｏ ｉ ｅ ｗ ｓ ａ ｄ ｄ ｔ ｈ ｕ ｔ ｒ ｓ ａ ｎ ｌ ｃ ｎ ｅ ｔ ｔ ｎ ｏ ／ ｎ ４ ． Ｒｅ ｕ ｔ： Ｔ ｅ ｎ ｕ ｎ ｃ ｌ ｈ ｗｅ ｙ ｉａ ｄ ｅ ｏ ｔ ｅ ｃ ｌ ｅ ｔ ａ ｆ ａ ｏ ｃ ｎ ｒ ｉ ｆ ５ ｍｇ ｍＬ ｏ ０ ｈ ｕ ｉ ａｏ ｓｌ ｓ ｈ ｅ ｒ ｅｌ ｓ ｏ ｄ ａ ｔｐ ｃ ｌ ｏ ｓ
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［ ｙ ｗ ｒ ｓ ｃｒｂａ ｃｒ ｘ ｎｕｏａ ｃｌ； ｕｔｒ；Ｂ Ｌ ／ ｉ Ｋｅ ｏｄ ］ ｅ ｒｌ ｏ ｅ； ｅ ｒｎｌ ｅ ｓ ｃ ｌ ｅ Ａ Ｂ ｃ ｍｃ ｅ ｔ ｌ ｕ ｅ
中枢神 经 系统包 含 ２类 细 ຫໍສະໝຸດ Baidu ， 即神 经 元 和神 经
胶 质细 胞 ， 这些 细胞 构成 高 度复 杂 的神 经 元 和神 经 胶 质细胞 网络 。神 经元 细胞体 外培养 是研究 神经 系
ｇｒ ｎ ａ ｏ ｅ等采 用新 生 Ｓ／ ／ ｚ ＪＬ Ｌ小 鼠 ［ Ａ ｌｍ ｙｒ 采 ２ ｈｅ ｅ ｅ 等 １ 、
用 新 生 Ｃ ５ Ｂ ／ Ｊ 鼠皮 层 ［ Ｄ ７ １６ 小 ３ １ 进行 了神 经 元 培 养 。
胞 苷 购 自 Ｓｇ ｉ ｍａ公 司 ； ｅｒｂ ｓｌ 养 基 、 ＭＥ Ｎ ｕｏ ａａ 培 Ｄ Ｍ／
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Ｆ ２培 养基 、 一 氨酰 胺 、 ２ 、抗 生 素一 真 菌素 、 １ Ｌ谷 Ｂ７ 抗
小 鼠神 经细 胞与 大 鼠神经 细胞 具 有 很大 的不 同 ， 在 神 经元培 养 上需要 注 意胰 酶 消化 的浓 度 和 时 间 、 加 入 阿糖胞苷 抑制神 经胶质 细胞 的时机 等 。我 们经过
净 台内风干 。
取 新生 Ｂ Ｌ ／ 小 鼠， 离硬 脑膜 ， 下大脑 皮 ＡＢｃ 剥 摘 质 （ 上操 作 ） 置 于装 有 预 冷 磷 酸盐 缓 冲液 （Ｂ ） 冰 ， Ｐ Ｓ 的离 心 管 中 ， 完 全 部 大脑 皮 质 后 吸 去上 清 ， 冷 取 用 Ｐ Ｓ冲洗 ２次 ， 上清 ， 预 冷 的含 Ｐ Ｓ的培 养 皿 Ｂ 弃 在 Ｂ 中剪 碎组 织 ；加 入 等量 预 热 至 室温 的 ０２ ％胰 酶 ， ．５
１ 材 料 和 方 法
１１ 材 料 ．
统 疾病 、神 经元 与神 经 胶质 细 胞关 系 的重 要技 术 。 神 经元细 胞培养一 般采 用孕 鼠， 多数 采用 大 鼠【 ｌ 】 。小 鼠虽然 是研 究神 经 系统疾 病 的重 要模 型 ， 用 新生 但
小 鼠进行 神经 元培 养 的方 法 文献却 较 少 ， 见 Ｂ ｎ 仅 ｏ—
定 １ ｉ ，Ｂ ５ ｍ ｎ Ｐ Ｓ洗 ３次 ； 用 ０１ 再 ． ％的 Ｔｉ ｎ ０ ｒｏ ｌ０穿 透 ｔ 细胞 １ ｉ， Ｂ ０ ｒ ｎ Ｐ Ｓ洗 ３次 ；加 抗 神经 元特 异 １ 微 ａ １ １
１ 小鼠 大脑 皮质神 经元 细胞 原代培 养 ． ２ 细胞 培养 板 （ ｏｔ ） 使用 前 用 ００ ％的 Ｌ 多 Ｃ ｓ ｒ在 ａ ．１ 一 聚 赖氨 酸 包 被 ， 温 过 夜后 用 双 蒸 水洗 ３次 ， 超 室 置
出生 ２ ４ ｈ内的 Ｂ Ｌ ／ 小 鼠 ， ＡＢｃ 由汕头 大学 医学 院实 验动物 中心提供 。 神 经元培 养 中所需 Ｌ 多 聚赖氨 酸 （ｏ — —ｙ 一 ｐｌ Ｌ Ｉ ｙ —
ｓ ｅ ｈ ｄｏ ｒｍ ｄ ， ｉ ｙｒｂｏ ｉｅ 相对 分 子 质量 ≤１０ ０ ０ 、 ｎ ５ ０ ） 阿糖
管蛋 白 （ｂ ８ ０ ） 自 Ａ ｃ ｍ公 司 ； 光 素 标 记 的 ａ １２ ７ 购 ｂａ 荧 山羊抗 兔 ＩＧ购 自 Ｉｖ ｒｇｎ公 司 。 ｇ ｎ ｉｏ ｅ ｔ
１ 免 疫 荧 光 技 术 鉴 定 神 经 元 细 胞 ． ３
神经元 特异 的 Ｂ Ｉ Ｈ 微管蛋 白在 胚胎 和 出生后 的 中枢和 外周 神经 系 统 中表达 丰 富 ， 布在 神经 元整 分 个 细胞 中 ， 包括 细胞 浆 、 突和 树 突 ， 神 经元 的特 轴 是 异 性标 志之 一 。 由于其 表达 量 大 ， 且分 布 于 整个 细 胞 ，因此 免疫 染色 效果 较好 。神经 元 细胞 培养 ５ ｄ 后 ， 预冷 的 Ｐ Ｓ洗 ３次 ， 用 Ｂ 用预 冷 的 ４ ％多 聚 甲醛 固
［ 键 词 】 大 脑 皮质 ； 经元 细 胞 ； 养 ；Ａ Ｂ ｃ小 鼠 关 神 培 Ｂ Ｌ／
【 中图 分 类号 ］ Ｑ １． ８ ３１
［ 献标 识 码 】 Ａ 文
［ 章 编 号 】 １０ — ０ ２２ １）１０ ８ －４ 文 ０９ ００ （０ １ — ０ ５ ０ ０
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