基因克隆详细步骤说明书

实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

[实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知）

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。

[仪器、材料与试剂]

(一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器

(二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿

(三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨 (tryptone) 10g酵母提取物 (yeast extract) 5g NaCl 10g

摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。

3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。

[实验步骤]

1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。

2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。

以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。

3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。

4．将上述细胞分装于1.5mL离心管 (离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。

5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。

转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。

2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。

3．冰上放置30分钟。

4．42℃水浴热激60秒。

5．冰上放置2分钟。

6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。

7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。 8．将细菌涂布在 Amp/LB琼脂平板上。

9．平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。 [实验结果]经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每mg 质粒DNA 转化的菌落数表示。

实验二 质粒DNA的提取

[实验原理]

碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0‐12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质‐SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

[仪器、材料与试剂]

(一)仪器1．恒温培养箱2．恒温摇床3．小型高速离心机4．高压灭菌锅

(二)材料1．带有pQE‐31质粒和pUC18‐CAT质粒的两株大肠杆菌2．1.5mL 离心管3．枪头、枪

(三)试剂质粒小量制备试剂盒(3S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司)

试剂盒的参考配方:Solution I 50mmo1／L 葡萄糖，5mmo1／L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0)，1.0 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)，Solution II 0.4mo1／L Na0H，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合Solution II I5mo1／L 醋酸钾，60 mL冰乙酸 11.5mL水，28.5mL TE缓冲液，10mmo1／L Tris·HCl1mmo1／L EDTA(pH8.0)，胰RNA酶(RNA 酶A)，将RNA酶溶于10mmo1／L Tris·HCl(pH7.5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL 的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于‐20℃。

[实验步骤]

(一)提取质粒将3mL含Apm的LB液体培养基加入到两支试管中，分别接入含pQE‐31质粒和pUC18‐CAT的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。以下的操作按试剂盒的说明书进行。(附试剂盒说明书)(二)质粒的琼脂糖凝胶电泳

将5mL洗脱液与3mL的DNA样品缓冲液混合，加于1.2% Agarose 做凝胶电泳分析。

附：试剂盒说明书

3S Spin Plasmid Miniprep Kit V 3．1上海申能博彩生物科技有限公司bbst＠shl63．net www．

试剂盒组成：

组成 K1910（50次） K1920（100次） K1930（250次）

Solution I(a) 5m1 10m1 25m1

Solution II(b) 10m1 20m1 50ml

Solution lll 20m1 50m1 2x50m1

Wash Solution (c) 22m1 2x22m1 5x22m1

TE(d) 5m1 10m1 40m1

3S Column 50支 100支 250支

Co11ection tube 50支 100支 250根

说明书 1份 1份 l份

注：

a)Solution I内含RNaseA，每次实验结束后，4℃保存。

b)温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。