沙门氏菌六种检测方法的研究

PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
普 通 PCR 法
特异性检测
普 通 PCR 法
11ng 1.1ng 0.1ng 11pg 1.1pg 0.1pg 0.01pg
灵敏性检测
实时荧光PCR法
SYBR Green Ⅰ 上游引物（P1） 下游引物（P2） DNA模板 dH2O 95℃ 95℃ 60℃ 65℃ 95℃ 30s 5s 20s 15s 0.1℃/ s 10µL 0.4μL 0.4μL 2μL 7.2μL
普 通 PCR 法
10×Buffer(Mg2＋) dNTP(2.5mM) 上游引物（ invA-F ） 下游引物（ invA-R ） 模板DNA 双蒸水 5μL 6μL 1μL 1μL 5μL 31.7μL
50μL
95℃ 95℃ 60℃ 72℃ 72℃
5min 10s 20s 60s 7min
38个循环
VITEK法：利用沙门氏菌常见的
29种生化反应，对1麦氏浊度的沙门
氏菌进行自动化检测，结果为99% Salmonella species， ＜1% Escherichia coli
VIDAS法
沙门氏菌经过1)前增菌；2) 增菌；3）后 增菌三步，进行上机检测，检测值为1.09≥检
测阈值0.23，判定为沙门氏菌为阳性。
6
比常规PCR更加 灵敏，更加的快 速。但此方法对 酶的活性、引物 特异性要求高， 检测费用昂贵
讨 论
六种方法都有各自的优缺点，单一的检测方法总是
有其难以解决的困难，针对传统方法的缺点，实验中
摒弃了传统的生化鉴定程序，结合API 20法和Vitek 法 别对沙门氏菌进行生化鉴定，这不仅减少了生化鉴定前 的实验准备，而且缩短了传统鉴定的时间。 针对PCR法出现气溶胶、样品间的交叉污染，死 活菌不能区别，产生假阳性结果的不足，我们可以引进
六种沙门氏菌检测方法 的研究
指导教师： 教授 老师 老师

班级： 学生： 学号：
级动医一班
报告内容
研究背景
研究内容 方法 结果
讨论
研究背景
沙门氏菌属是一群寄生在人和动物肠
道内的无芽孢直杆菌，能引起人和动
物的多种沙门氏菌病，是人类食物中 毒的主要病原之一，是食品安全与质 量检测的一项重要指标。
沙门氏菌在干制生化鉴定试剂盒的反应结果
氨基酸 赖氨酸 靛基质
尿素
氰化钾 氰化钾 甘露醇 山梨醇 对照
ONPG
+
+
―
―
―
―
+
+
―
血清学鉴定
O抗原鉴定
多价 O4 O
+ ―
O3
―
O10
―
O7
―
O8
―
O9
―
O2
―
O11
―
O1
+
O5
+
O27
+
H抗原鉴定
g ― f ― s ― i + b ― d ― a ― c ― h ― m ― w ―
20μL
两步法
RT-PCR
40个循环
实时荧光PCR法
标准曲线：y = -3.3971x + 27.313 相关系数：R²= 0.9996
标准曲线扩增图 标准曲线
实时荧光PCR法
灵敏性检测 融解曲线
讨 论
1
鉴定结果准确， 但步骤繁琐，耗 时4～7d
2
不需要特殊仪器， 操作方法简便， 但只能用于鉴定 单个细菌的纯培 养物，结果判定 依赖于操作者的 肉眼判断
美国的一种新检测方法，在检测样品中添加一种染料， 这种染料可以被死亡的沙门氏菌吸收。这种新的 PCR 法保留了 PCR检测快速、敏感、特异的优点，同时避 免了可能产生假阳性的缺点。
讨 论
在试图减少检测时间方面，美国科学家 R Ferretti用沙门氏菌在缓冲蛋白胨水BPW 中非选择性增菌6h，再进行细菌DNA提取 和普通PCR实验，此方法仅用时12h。在实 时荧光PCR中引入此方法，缓冲蛋白胨水 增菌6h，45min水煮法提取DNA，实时荧光 PCR30min，在8h内就能检测出沙门氏菌。
讨 论 传统的方法结合API 20E和Vitek法对一 般细菌的检测都能做到直接、快速和准确。 当有大量的待检样品时，VIDAS法可以快 速、准确的判断出细菌的阴阳性，再结合 传统方法进行检测，即节省了时间又避免 了假阳性、假阴性对检测的影响。当某地 区发生突发性的细菌病时，采用实时荧光 PCR法可在8h内检测出细菌的阴阳性，再 结合血清学鉴定，为细菌病的治疗、防控 奠定了基础。
研究背景
沙门氏菌的风暴已经席卷全球
六种沙门氏菌的检测方法
一 传 统 检 测 法
二
三
四
TEXT
五
六
API 20 VITEK 法 法
VIDAS 法
普 通 PCR 法
实 时 荧 光 法
5
传统检测法
4.血清学鉴定 3.生化鉴定 2.染色特性 1.培养特性
One Two Three
Four
Company Logo
3
快速、准确，操 作步骤简便，人 为因素的影响小， 但是鉴定时需要 纯培养，对菌悬 液的制备和浓度 也有要求
讨 论
4
检测范围广，耗 时短，不需要样 品前处理和纯化， 且稳定性高，但 需要特殊的仪器 和设备，使用成 本高
5
简便、快速、对 标本的纯度要求 低,但容易出现气 溶胶、样品间的 交叉污染，死活 菌不能区别，产 生假阳性结果
致 谢
感谢
教授悉心指导。
感谢甘肃省出入境检疫检验综合技术中心给予我这次实习
的机会，感谢
老师和
师姐在实验过程中和的教导，
让我真正感觉到我们专业的作用，同时也增长了不少的专 业知识和兴趣。 感谢动物医学院所有老师的细心教导，以及大学4年来对 我的帮助和关心 。
沙门氏菌在各培养基上的典型特征
A. BS琼脂平板
B. SS琼脂平板
C. 显色培养基
D. XLD琼脂平板
染 色 特 性
A.标准菌株：ATCC 14028
生 化 鉴 定
沙门氏菌生化试验反应结果
三糖铁琼脂 底层 产气
斜面
硫化氢
赖氨酸 OPNG 脱羧酶 + ―
V-P ―
吲哚 ―
K
A
+
+
注： K：产碱； A：产酸； +：阳性；―：阴性
最后得出结果为（1,4,5,12：i） 判定为鼠伤寒沙门氏菌
API 20法
API 20E法根据沙门氏菌的21个生化反应，每3个试验
为一组，每个阳性试验分别赋予数值1、2或4，阳性反应
以相应的数值相加，根据鉴定手册鉴定为Salmonella spp
沙门氏菌API-20E 试条中的生化反应结果
ห้องสมุดไป่ตู้
VITEK法