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基因定点突变技术简介：

一般来说，基因突变是不定向的，是随机的，且突变频率非常低。而通过定点突变技术，可以按照预定设计，对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，因此基因定点突变技术是蛋白质工程研究中的重要工具。基因定点突变主要有以下三种方法：

1.寡核苷酸介导的定点突变

该方法以M13噬菌体的DNA为载体，在操作时，首先利用转基因技术，将待诱变的目的基因插入到M13噬菌体的正链DNA上，制备含有目的基因的单链DNA。再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分，将其转入细胞后，经过不断复制，可获得突变的DNA分子。

Stratagene公司研制了QuikChange

Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit即是在此

种方法上进行改良的：以含目的DNA的质粒为

模板，在要突变处设计一对反向互补的引物，

用高保真酶进行扩增，再用dpnI消化掉质粒模

板，将已经形成环状的PCR产物转化进大肠杆

菌就可以。

2．盒式定点突变

该方法是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷

酸片段，取代野生型基因中相应序列。这种突变的寡

核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当其退火时，按设计

要求产生克隆需要的黏性末端。由于不存在异源双链的

中间体，因此重组质粒全部是突变体。但这种方法需要

在靶DNA区段的两侧存在一对限制酶单切点，限制了该

方法的使用。

3.PCR介导的定点突变

经典PCR介导的定点突变法，需要4种扩增引物，进行3次PCR反应(见图2)。头两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，去除未参入的多余引物之后，这两条双链DNA 片段经变性和退火可以形成具有3’凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子。这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三次PCR扩增，便产生突变体DNA。