Westernblot发光检测中常见的问题及解决方法
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众所周知，Western blot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。
Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。
条带内无显影的白点与转膜和显影的操作有关。转膜前尽量将膜平衡，并注意胶和膜之间避免气泡，显影时膜与X光片间也应避免气泡。
散在小圆斑是牛奶封闭液中的杂质颗粒导致的，解决此类问题可提前配置好封闭液于4度保存，使用时勿混匀，仅用上层。
Western blot发光检测中常见问题及解决办法
现象
原因
解决办法
信号弱或无
背景较高。背景深是在Western blot发光检测中最常见的问题，造成背景深的原因很多。第一，封闭的问题，封闭条件一般为5%牛奶或BAS室温封闭2-4h，但最好4度过夜；实际上牛奶对于多数抗体来说效果不错，但二抗与牛奶可能有交叉反应，因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脱不彻底也会导致背景深，适当增加洗脱时间、次数、用量可以减轻背景颜色。第三，条带背景深也与曝光时间有关，曝光时间超过半小时出现背景是很正常的，所以可以的话建议曝光1-10min。英格恩公司生产的Westernblot发光试剂EnlightTM含独特的发光增强剂和精准的发光底物，比普通发光试剂灵敏度更高、更稳定，而且发光时间长，背景更低。第四，抗原-抗体浓度/HRP过高时，直接或间接结合在膜上，洗脱不掉等原因，考虑降低抗体浓度或蛋白上样量。
增加洗脱时间、次数、用量
曝光时间过长
降低曝光时间
抗原-抗体浓度过高
降低抗体浓度或蛋白上样量
条带内无显影的白点
转膜不良（如有气泡在胶-膜之间)
精细操作
膜平衡不均/油脂污染
按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜
膜与X光片间有气泡
显影前去除气泡
非特异性条带
抗体交叉反应
稀释一抗/二抗
散在小圆斑
封闭液有杂质颗粒
图2 Western blot发光检测中常见的问题及比较
非特异性条带。非特异性条带与抗体交叉反应有关。单抗比多抗特异性好，纯度高，另外适当稀释一抗/二抗浓度，也是有必要的。如果样本在处理过程中发生降解，则样本处理时加入蛋白抑制剂在冰上操作。
显影后膜上条带处变为黄色或为白色。可能是HRP过高导致的敏感性或背景太高，应降低抗体浓度。
Western blot发光检测中常见的问题及解决方法
免疫印迹试验（Western blot）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL，文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。
图1 ECL检测原理图
Western blot发光检测受多种因素影响，主要包括：抗原含量，抗体敏感度，底物敏感度，显影和定影效率，等。现根据检测中几种常见的现象问题进行分析：
目的蛋白信号弱或无。在Western blot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。首先考虑是否转膜不充分/过转，如果是，则要优化转膜条件；其次，在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。曝光时间短也会使蛋白信号降低，因此，要延长胶片的曝光时间。
HRP过高引起底物迅速耗竭
稀释一抗/二抗
抗体-抗原系统敏感性过低
提高抗体浓度/蛋白上样量
转膜不充分/过转
优化转膜条件
HRP或底物活性降低
测试活性或选用敏感底物
高背景
HRP过高(背景较高)
稀释一抗/二抗
封闭时间不足
延长封闭时间4度过夜最好
抗体与封闭液有交叉
更换封闭液(如3%BSA的TBST)
TBST洗脱不足
ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（lumino，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。ECL法操作简便，应用现成的试剂盒，按照说明，将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影、定影（或用荧光检测仪检测）。ECL法具有灵敏度高，线性范围广等特点。
静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层
反影(白色条带,黑色背景)
HRP过高(背景较高)Fra bibliotek稀释一抗/二抗
显影后膜上条带处变为黄色
HRP过高(敏感性太高)
稀释一抗/二抗
底物化学发光ECL是Western blot最常用的显色方法之一，因此，熟悉并掌握其中最常出现的问题及解决办法是做好Western blot发光检测的基础。
Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。
条带内无显影的白点与转膜和显影的操作有关。转膜前尽量将膜平衡，并注意胶和膜之间避免气泡，显影时膜与X光片间也应避免气泡。
散在小圆斑是牛奶封闭液中的杂质颗粒导致的，解决此类问题可提前配置好封闭液于4度保存，使用时勿混匀，仅用上层。
Western blot发光检测中常见问题及解决办法
现象
原因
解决办法
信号弱或无
背景较高。背景深是在Western blot发光检测中最常见的问题，造成背景深的原因很多。第一，封闭的问题，封闭条件一般为5%牛奶或BAS室温封闭2-4h，但最好4度过夜；实际上牛奶对于多数抗体来说效果不错，但二抗与牛奶可能有交叉反应，因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脱不彻底也会导致背景深，适当增加洗脱时间、次数、用量可以减轻背景颜色。第三，条带背景深也与曝光时间有关，曝光时间超过半小时出现背景是很正常的，所以可以的话建议曝光1-10min。英格恩公司生产的Westernblot发光试剂EnlightTM含独特的发光增强剂和精准的发光底物，比普通发光试剂灵敏度更高、更稳定，而且发光时间长，背景更低。第四，抗原-抗体浓度/HRP过高时，直接或间接结合在膜上，洗脱不掉等原因，考虑降低抗体浓度或蛋白上样量。
增加洗脱时间、次数、用量
曝光时间过长
降低曝光时间
抗原-抗体浓度过高
降低抗体浓度或蛋白上样量
条带内无显影的白点
转膜不良（如有气泡在胶-膜之间)
精细操作
膜平衡不均/油脂污染
按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜
膜与X光片间有气泡
显影前去除气泡
非特异性条带
抗体交叉反应
稀释一抗/二抗
散在小圆斑
封闭液有杂质颗粒
图2 Western blot发光检测中常见的问题及比较
非特异性条带。非特异性条带与抗体交叉反应有关。单抗比多抗特异性好，纯度高，另外适当稀释一抗/二抗浓度，也是有必要的。如果样本在处理过程中发生降解，则样本处理时加入蛋白抑制剂在冰上操作。
显影后膜上条带处变为黄色或为白色。可能是HRP过高导致的敏感性或背景太高，应降低抗体浓度。
Western blot发光检测中常见的问题及解决方法
免疫印迹试验（Western blot）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL，文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。
图1 ECL检测原理图
Western blot发光检测受多种因素影响，主要包括：抗原含量，抗体敏感度，底物敏感度，显影和定影效率，等。现根据检测中几种常见的现象问题进行分析：
目的蛋白信号弱或无。在Western blot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。首先考虑是否转膜不充分/过转，如果是，则要优化转膜条件；其次，在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。曝光时间短也会使蛋白信号降低，因此，要延长胶片的曝光时间。
HRP过高引起底物迅速耗竭
稀释一抗/二抗
抗体-抗原系统敏感性过低
提高抗体浓度/蛋白上样量
转膜不充分/过转
优化转膜条件
HRP或底物活性降低
测试活性或选用敏感底物
高背景
HRP过高(背景较高)
稀释一抗/二抗
封闭时间不足
延长封闭时间4度过夜最好
抗体与封闭液有交叉
更换封闭液(如3%BSA的TBST)
TBST洗脱不足
ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（lumino，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。ECL法操作简便，应用现成的试剂盒，按照说明，将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影、定影（或用荧光检测仪检测）。ECL法具有灵敏度高，线性范围广等特点。
静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层
反影(白色条带,黑色背景)
HRP过高(背景较高)Fra bibliotek稀释一抗/二抗
显影后膜上条带处变为黄色
HRP过高(敏感性太高)
稀释一抗/二抗
底物化学发光ECL是Western blot最常用的显色方法之一，因此，熟悉并掌握其中最常出现的问题及解决办法是做好Western blot发光检测的基础。