第八章 蛋白质和氨基酸的测定ppt课件
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
.
二、自动凯氏定氮法
将凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的 一套装置，原理与试剂同前。 ▪ 自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏 装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示 装置。 ▪ 消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红 外线加热装置组合而成的消化炉。
.
方法特点及应用范围
• 灵敏 • 准确 • 快速 • 样品用量少
第八章 蛋白质及氨基酸的测定
.
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein） • C：50-55% N：15-18% O：20-23% • H：6-8% S：0-4% • 微量元素：P、Fe、Zn、Cu 2、基本结构单位：氨基酸 3、蛋白质的变性作用。
.
4、蛋白质分析的重要性
将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准溶 液直接滴定至由蓝色变为微红色（用甲基 红－溴甲酚绿混合指示剂）即为终点，同 时作一试剂空白。
.
• Page 158 公式
计算
.
• 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶 冷却，加入30%过氧化氢2～3ml后再继续消化。
• 一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可， 但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品， 如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨 酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解 完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时， 呈较深绿色。
K2SO4 + H2SO4 → 2KHSO4 2KHSO4 → K2SO4 + H2O↑+ SO2
.
• 硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系 温度过高，又会引起引起生成的铵盐发 生热分解放出氨而造成损失。
• 除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化 钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸 钾。
.
（2） （催化剂、指示剂）硫酸铜
.
三、微量凯氏定氮法
• 原理及适用范围同常量凯氏定氮法 • 主要仪器：凯氏烧瓶（100mL）；微量凯氏
定氮仪 • 试剂：0.01000mol/L HCl 标准液，其余同常
蛋白质含量 16.0 15.7 18.76 17.70 18.66 18.12 19.34
.
换算系数 6.25 6.38 5.33 5.56 5.36 5.52 5.17
在消化反应中,为了加速蛋白质的分解, 缩短消化时间,常加入下列物质
1）硫酸钾:
提高溶液的沸点，加快有机物分解。它与硫酸作用生 成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在 340℃左右,而添加硫酸钾后,可使温度提高至400℃以 上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解, 水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大,故沸点升高,其反 应式如下：
.
一、凯氏定氮法（常量）
凯氏定氮法通过测出样品中的总含氮量再乘以 相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样 品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的 结果称为粗蛋白含量。
此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等 也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速， 故多用于生产单位质量控制分析。
.
原理
• 样品与浓硫酸（氧化、脱水）和催化 剂（硫酸铜）一同加热消化，使蛋白 质分解，其中C,H氧化为CO2和H2O， 有机N转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。 加碱蒸馏时氨蒸出，用硼酸吸收后， 再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。
.
• 样品制备 • 消化 • 中和、蒸馏 • 滴定 • 计算
利用换算系数可以把氮的百分含量转化成样 品粗蛋白质含量。由于大部分蛋白质含有16% 的氮，所以其换算系数一般为6.25（100/16 = 6.25）。
即： %N × 6.25 = %蛋白质
.
部分食品的蛋白质换算系数*
蛋或肉 牛奶 小麦 玉米 燕麦 大豆 大米
.
蒸馏
吸取5mL稀释后的消化液→加入凯氏定 氮仪内→加10mL40%的氢氧化钠→夹好漏斗 夹→冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶内预 先装入10ml4%硼酸溶液及混合指示剂) → 加热蒸馏至氨全部蒸出(由红变蓝后约10分 钟) →将冷凝管下端提离液面→用蒸馏水 冲洗管口→继续蒸馏1分钟→加热。
.
滴定
• 生物活性测定 • 功能性质调查 • 营养标签
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
.
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
利用特定氨基பைடு நூலகம்残基法
.
凯氏定氮法 杜马斯法 福林酚法 染色法
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。 二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法）
• 蒸馏装置不能漏气。 • 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢
氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。
.
• 硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对 氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置 于冷水浴中使用。
• 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面， 清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可 能造成吸收液倒吸。
起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧 化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机 物氧化。 指示消化终点的到达，为清澈的蓝绿色。 指示蒸馏时的碱加入量是否足够。 除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、二 氧化钛等也可用的催化剂。
.
装置
.
操作步骤
消化 准确称取固体样品0.2～2g（半固体样品2～5g， 液体样品10～20ml）→移入凯氏烧瓶→加入研细 的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml→摇匀→ 安装消化装置→于凯氏瓶口放一漏斗→以45°角 斜支于有小孔的石棉网上→用电炉先以小火加热 至内容物全部炭化，泡沫停止后→加大火力保持 瓶内液体微沸→至液体变蓝绿色透明→继续加热 微沸30分钟→冷却→ 定容。 加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。
.
蛋白质的测定方法
• 1凯氏定氮法（1833年Kieldahl,常量法、微量法、自动 定氮仪、半微量法、改良凯氏定氮法）
• 2双缩脲法 • 3福林酚（Lowry）法 • 4 Bicinchoninic Acid 法 • 5 280nm紫外吸收法 • 6染色法 • 6.1阴离子染色法 • 6.2布兰德福特（Bradford）法 • 7茚三酮法 • 8比浊法 • 9杜马斯法（燃烧法） • 10 红外光谱法
二、自动凯氏定氮法
将凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的 一套装置，原理与试剂同前。 ▪ 自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏 装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示 装置。 ▪ 消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红 外线加热装置组合而成的消化炉。
.
方法特点及应用范围
• 灵敏 • 准确 • 快速 • 样品用量少
第八章 蛋白质及氨基酸的测定
.
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein） • C：50-55% N：15-18% O：20-23% • H：6-8% S：0-4% • 微量元素：P、Fe、Zn、Cu 2、基本结构单位：氨基酸 3、蛋白质的变性作用。
.
4、蛋白质分析的重要性
将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准溶 液直接滴定至由蓝色变为微红色（用甲基 红－溴甲酚绿混合指示剂）即为终点，同 时作一试剂空白。
.
• Page 158 公式
计算
.
• 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶 冷却，加入30%过氧化氢2～3ml后再继续消化。
• 一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可， 但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品， 如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨 酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解 完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时， 呈较深绿色。
K2SO4 + H2SO4 → 2KHSO4 2KHSO4 → K2SO4 + H2O↑+ SO2
.
• 硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系 温度过高，又会引起引起生成的铵盐发 生热分解放出氨而造成损失。
• 除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化 钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸 钾。
.
（2） （催化剂、指示剂）硫酸铜
.
三、微量凯氏定氮法
• 原理及适用范围同常量凯氏定氮法 • 主要仪器：凯氏烧瓶（100mL）；微量凯氏
定氮仪 • 试剂：0.01000mol/L HCl 标准液，其余同常
蛋白质含量 16.0 15.7 18.76 17.70 18.66 18.12 19.34
.
换算系数 6.25 6.38 5.33 5.56 5.36 5.52 5.17
在消化反应中,为了加速蛋白质的分解, 缩短消化时间,常加入下列物质
1）硫酸钾:
提高溶液的沸点，加快有机物分解。它与硫酸作用生 成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在 340℃左右,而添加硫酸钾后,可使温度提高至400℃以 上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解, 水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大,故沸点升高,其反 应式如下：
.
一、凯氏定氮法（常量）
凯氏定氮法通过测出样品中的总含氮量再乘以 相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样 品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的 结果称为粗蛋白含量。
此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等 也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速， 故多用于生产单位质量控制分析。
.
原理
• 样品与浓硫酸（氧化、脱水）和催化 剂（硫酸铜）一同加热消化，使蛋白 质分解，其中C,H氧化为CO2和H2O， 有机N转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。 加碱蒸馏时氨蒸出，用硼酸吸收后， 再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。
.
• 样品制备 • 消化 • 中和、蒸馏 • 滴定 • 计算
利用换算系数可以把氮的百分含量转化成样 品粗蛋白质含量。由于大部分蛋白质含有16% 的氮，所以其换算系数一般为6.25（100/16 = 6.25）。
即： %N × 6.25 = %蛋白质
.
部分食品的蛋白质换算系数*
蛋或肉 牛奶 小麦 玉米 燕麦 大豆 大米
.
蒸馏
吸取5mL稀释后的消化液→加入凯氏定 氮仪内→加10mL40%的氢氧化钠→夹好漏斗 夹→冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶内预 先装入10ml4%硼酸溶液及混合指示剂) → 加热蒸馏至氨全部蒸出(由红变蓝后约10分 钟) →将冷凝管下端提离液面→用蒸馏水 冲洗管口→继续蒸馏1分钟→加热。
.
滴定
• 生物活性测定 • 功能性质调查 • 营养标签
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
.
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
利用特定氨基பைடு நூலகம்残基法
.
凯氏定氮法 杜马斯法 福林酚法 染色法
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。 二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法）
• 蒸馏装置不能漏气。 • 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢
氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。
.
• 硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对 氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置 于冷水浴中使用。
• 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面， 清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可 能造成吸收液倒吸。
起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧 化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机 物氧化。 指示消化终点的到达，为清澈的蓝绿色。 指示蒸馏时的碱加入量是否足够。 除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、二 氧化钛等也可用的催化剂。
.
装置
.
操作步骤
消化 准确称取固体样品0.2～2g（半固体样品2～5g， 液体样品10～20ml）→移入凯氏烧瓶→加入研细 的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml→摇匀→ 安装消化装置→于凯氏瓶口放一漏斗→以45°角 斜支于有小孔的石棉网上→用电炉先以小火加热 至内容物全部炭化，泡沫停止后→加大火力保持 瓶内液体微沸→至液体变蓝绿色透明→继续加热 微沸30分钟→冷却→ 定容。 加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。
.
蛋白质的测定方法
• 1凯氏定氮法（1833年Kieldahl,常量法、微量法、自动 定氮仪、半微量法、改良凯氏定氮法）
• 2双缩脲法 • 3福林酚（Lowry）法 • 4 Bicinchoninic Acid 法 • 5 280nm紫外吸收法 • 6染色法 • 6.1阴离子染色法 • 6.2布兰德福特（Bradford）法 • 7茚三酮法 • 8比浊法 • 9杜马斯法（燃烧法） • 10 红外光谱法