1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验

第一天

1、配置LB培养基：

酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。

2、接种（超净台要提前杀菌通风）

取4瓶上述培养基，每瓶加200µlAMP（1:1000）、60µl菌液。37℃过夜。

第二天

1、扩大培养（超净台）

4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200µlAMP，摇床培养1小时左右。

2、诱导（超净台）

加40µlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。

3、离心获取菌体

4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。

4、超声波破碎菌体

离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300µl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。

600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。

超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。

5、抽滤（双层滤纸)

洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。

第三天

1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20µl，留电泳。

2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去

上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。

3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20µl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳）

4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。

洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH

透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT

透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS