第六章 色谱分析法

第六章色谱分析法

第一节色谱法的来源与特点

一、色谱法的来源

色谱法（chromatography）早在1903年由俄国植物学家茨维特最先发明并定义，他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。他称之为色谱。这种方法因此得名为色谱法，又称层析法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离。

二、色谱法的特点和优点

色谱分析法的特点：

具有高超的分离能力，而各种分析对象又大都是混合物，为了分析鉴定它们是由什么物质组成和含量是多少，必须进行分离，所以色谱法成为许多分析方法的先决条件和必需的步骤。

色谱法的优点：

（1）分离效率高。

（2）应用范围广。

它几乎可用于所有化合物的分离和测定，无论是有机物、无机物、低分子或高分子化合物，甚至有生物活性的生物大分子也可以进行分离和测定。

（3）分析速度快。

一般在几分钟到几十分钟就可以完成一次复杂样品的分离和分析。

（4）样品用量少。

用极少的样品就可以完成一次分离和测定。

（5）灵敏度高。

例如GC可以分析几纳克的样品。

第二节色谱过程和基本原理

一、色谱过程

实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相和流动相。

色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。

组分的结构和性质微小差异与固定相作用差异随流动相移动的速度不等差速迁移色谱分离。

二、色谱流出曲线和有关概念

1.色谱流出曲线

是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。

2.基线

是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。基线反映仪器（主要是检测器）的噪音随时间的变化。

3.色谱峰

是流出曲线上的突起部分。

正常色谱峰、拖尾峰和前延峰。

对称因子fs（symmetry factor）：衡量色谱峰的对称性。

4.定性参数

（1）保留时间（t R）：从进样开始到某个组分色谱峰顶点的时间间隔称为该组分的保留时间。

（2）死时间（t0）：分配系数为零的组分的保留时间称为死时间，是流动相充满输液系统管路、色谱柱空隙及检测池所需的时间。

（3）调整保留时间（）：组分在固定相中停留的时间称为调整保留时间。

调整保留时间与保留时间和死时间有如下关系：

=t R-t0

（4）相对保留值（r）两组分的调整保留值之比称为相对保留值，又称选择性因子。即：

r2,1=／=k2／k1

5.定量参数

（1）峰高（peak height；h）：组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。

（2）峰面积（peak area；A）：色谱曲线与基线间包围的面积。

6.柱效参数

（1）标准差（standard deviation；σ）：正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半，即0.607倍峰高处的峰宽之半。

σ的大小表示组分被带出色谱柱的分散程度。

σ越大，组分越分散；反之越集中。

（2）半峰宽（W1/2）：峰高一半处的峰宽。

W1/2=2.355σ

（3）峰宽（peak width；W）：色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。

W=4σ或W=1.699W1/2

7.总分离效能指标

分离度（resolution；R）：又称分辨率，是相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。

三、分配系数与色谱分离

（一）分配系数和容量因子

分配系数（distribution coefficient；K）：是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相（s）与流动相（m）中的浓度（C）之比。

分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度（和压力）有关。是组分的特征常数。

容量因子（capacity factor；k）：在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量（m）之比。

又称为质量分配系数或分配比。

还与固定相和流动相的体积有关。

容量因子与分配系数的关系：

（二）色谱分离的前提

KA≠KB或kA≠kB是色谱分离的前提。

第三节色谱方法基本类型及其分离机制

分配色谱法

吸附色谱法

离子交换色谱法

空间排阻色谱法

一、分配色谱法

分离原理：利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。

溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则K越大。

固定相：

又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体）；化学键合相（通过化学反应将各种有机基团键合到载体上形成的固定相）。

流动相：

气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。

液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。

正相液液分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性。

反相液液分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性。

二、吸附色谱法

分离原理：利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。

吸附过程是试样中组分的分子（X）与流动相分子（Y）争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程。

固定相：

多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。硅胶表面硅醇基为吸附中心。

经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶

高效液相色谱：球型或无定型全多孔硅胶和堆积硅珠。

气相色谱：高分子多孔微球。

流动相：有机溶剂

洗脱能力：主要由其极性决定，强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力强，使k值小，保留时间短。

三、离子交换色谱法

分离原理：利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。

四、空间排阻色谱法

分离原理：根据被分离组分分子的大小进行分离。

也称为分子排阻色谱法。

第四节薄层色谱法

薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）系将供试品溶液点样于涂布有固定相的薄层板上，经展开、检视后所得的色谱图，与适宜的对照物按同法操作所得的色谱图进行比较，主要用于药品的鉴别或杂质检查。

薄层色谱法属于平面色谱法的一种，按分离原理薄层色谱法主要有吸附、分配和分子排阻色谱法，以及胶束薄层色谱法等。

主要讨论在药品的鉴别和杂质检查中最为常用的吸附薄层色谱法。

一、基本原理

将A、B两组分的混合物溶液点样于薄层板的一端，在密闭的容器中用适当的流动相（展开剂）展开。