第十二章 色谱分析法基础

第十二章色谱分析法基础
教师：李国清
一.教学目的：
1. 熟练掌握色谱分离方法的原理；
2. 掌握色谱流出曲线（色谱峰）所代表的各种技术参数的准确含义；
3. 能够利用塔板理论和速率理论方程判断影响色谱分离各种实验
因素；
4. 学会各种定性和定量的分析方法。

二.教学重难点：
1. 塔板理论，包括理论塔板数（n）、有效塔板数（n eff）和塔板高
度（H）及有效塔板高度（H eff）的计算。

2. 速率理论方程
3. 分离度和基本分离方程
三．教具：
多媒体计算机、板书。

四．教学方法：
讲授、演示、提问、讨论。

五．教学过程
§12-1、色谱法的特点、分类和作用
一.概述
色谱法是混合物最有效的分离、分析方法。

俄国植物学家茨维特在1906年使用右图的装置分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（CaCO3有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。

色素受两种作用力影响：
（1）一种是CaCO3吸附，使色素在柱中停滞下来
（2）一种是被石油醚溶解，使色素向下移动。

各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。

色谱法是一种分离技术：
试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。

其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。

当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。

由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。

与适当的柱后检测方法结合，可实现混合物中各组分的分离与检测。

二．色谱法分类
1、按两相状态分类
气相色谱—气体作流动相：
（1）气固色谱：气体作流动相，固体吸附剂作固定相。

（2）气液色谱：气体作流动相，固定液作固定相。

液相色谱—液体作流动相：
（1）液固色谱：液体作流动相，固体吸附剂作固体相。

（2）液液色谱：液体作流动相，固定液作固定相。

超临界液体色谱——超临界流体作色谱流动相。

2、按操作形式分类
（1）柱色谱：
填充柱色谱—固定相填充到柱管内
毛细管柱色谱—把固定相涂在毛细管内壁上，中间是空的。

（2）纸色谱：
滤纸为固定相的色谱法，流动相是含一定比例水的有机溶剂，样品在滤纸上展开进行分离。

如下图。

（3）薄层色谱：把固体固定相压成或涂成薄膜的色谱法。

如下图。

3、按分离原理分类
（1）吸附色谱：利用吸附剂表面对被分离的各组分吸附能力不同进行分离。

（2）分配色谱：利用不同组分在两相分配系数或溶解度不同进行分离。

（3）离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行分离。

（4）凝胶色谱：利用凝胶对分子的大小和形状不同的组分所产生的阻碍作用不同而进行分离的色谱法。

三．色谱法的特点
（1）分离效率高
复杂混合物，有机同系物、异构体。

手性异构体
（2）灵敏度高
可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。

（3）分析速度快
一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。

（4）应用范围广
气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。

液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。

不足之处：
被分离组分的定性较为困难。

§12-２．色谱分离过程
一．分离机理：
色谱分离过程是在色谱柱内完成的。

填充柱色谱: 气固(液固)色谱和气液(液液)色谱，两者的分离机理不同。

①气固(液固)色谱的固定相: 多孔性的固体吸附剂颗粒。

作用原理：固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。

②气液(液液)色谱的固定相: 由担体和固定液所组成。

作用原理：固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。

因此：
气固色谱的分离机理: 吸附与脱附的不断重复过程；
气液色谱的分离机理：气液(液液)两相间的反复多次分配过程二、分配平衡：
１. 分配系数K
组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。

在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：
分配系数是色谱分离的依据，它有以下特点：
⑴一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；
⑵试样一定时，K主要取决于固定相性质；
⑶每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；
⑷选择适宜的固定相可改善分离效果；
⑸试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；
⑹某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。

2．分配比k
在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。

分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：
分配比也称：容量因子、容量比。

⑴分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。

⑵分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。

⑶分配比可以由实验测得。

3. 容量因子与分配系数的关系
式中β为相比（填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500）。

§12-3．色谱流出曲线与术语
h
1.基线
无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。

2.保留值
（1）时间表示的保留值
保留时间（t R）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；死时间（t M）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间；调整保留时间（t R＇）：t R＇= t R－t M
（2）用体积表示的保留值
保留体积（V R）：V R= t R×F0
F0 （m L / min）为柱出口处的载气流量。

死体积（V M）：
V M = t M×F0
调整保留体积(V R＇)：
V R＇= V R－V M
3. 相对保留值r21
组分2与组分1调整保留值之比：
r21 = t´R2/ t´R1= V´R2 / V´R1
相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。

4. 区域宽度
用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：
（1）标准偏差(σ)：即0.607倍峰高处色谱峰宽
度的一半。

（2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度Y1/2
=2.354 σ
（3）峰底宽(W b)：W b=4 σ
§12-3. 色谱理论
色谱理论需要解决的问题：影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。

有两种色谱理论：塔板理论和速率理论；
一、塔板理论
在50年代，色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论－塔板理论用于色谱分析法。

塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n个塔板，每个塔板高度称为理论塔板高度，用H表示，在每个塔板内，试样各组分在两相中分配并达到平衡，最后，挥发度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。

尽管这个理论并不完
全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。

对一个色谱柱来说，若色谱柱长度固定L ，每一个塔板高度H 越小，塔板数目越多，分离的效果越好，柱效越高。

塔板数用n 表示。

n =L/H 或 H=L/n
H 越小，n 越多，分离效果越好，用 H 、n 评价柱效。

由塔板理论导出n 与W b ， Y 1/2 的关系。

有时n 大，分离效果也不好，原因是保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配! 后来改用有效塔板数。

塔板理论的成功之处，提出了计算理论塔板高度、塔板数的公式及评价柱效的方法，具有开创性，但有一定局限性。

塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。

二、速率理论-影响柱效的因素
1．速率理论—范第姆特方程
1956年，荷兰学者范第姆特（VanDeomter
）提出一个描述色谱柱
分离过程中复杂因素使色谱峰变宽而致柱效降低（即：使H 增大）影响的方程。

此方程经简化后写为:
H = A + B/u + C·u
H：理论塔板高度，
u：载气的线速度(cm/s)
该式称为速率方程（范氏方程）。

下面我们将对公式中的各项进行讨论
⑴A─涡流扩散项
A = 2λdp
dp：固定相的平均颗粒直径
λ：固定相的填充不均匀因子
固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。

表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。

⑵B/u —分子扩散项
B = 2νDg
ν：弯曲因子，
Dg ：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm 2·s -1）
a ．存在着浓度差，产生纵向扩散;
b ．扩散导致色谱峰变宽，H ↑(n ↓)，分离变差;
c ．分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;
d ．扩散系数：Dg ∝(M 载气)-1/2 ； M 载气↑，B 值↓。

⑶ C ·u —传质阻力项
传质阻力包括气相传质阻力C g 和液相传质阻力C L 即： C =（C g + C L ）
其中，k 为容量因子； D g 、D L 为扩散系数。

减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。

2.载气流速与柱效——最佳流速
载气流速高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速⇑，柱效⇓。

载气流速低时：分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速⇑,
柱效
g
f
g D d k k C 2
2
)1(01.0⋅+=L
f
L D d k k C 22)1(32⋅
+⋅=。

H - u曲线与最佳流速：
由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。

以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。

3. 速率理论的要点
(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。

(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。

(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。

阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。

(4) 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，
使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。

三、色谱基本分离方程 １、分离度Ｒ
可以看出，分离效果与保留时间差和峰宽有关。

分离度的表达式：
R =0.8：两峰的分离程度可达89%； R =1：分离程度98%；
R =1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）
令W b(2)=W b(1)=W b （相邻两峰的峰底宽近似相等），引入相对保留值和塔板数，可导出下式：
)
(699.1)(2)(2)1(2/1)2(2/1)1()2()
1()2()1()2(Y Y t t W W t t R R R b b R R +-=
+-=
讨论：
（1）分离度与柱效
分离度与柱效的平方根成正比， r 21一定时，增加柱效，可提高分离度，但组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长。

（2）分离度与r 21
增大r 21是提高分离度的最有效方法，计算可知，在相同分离度下，当r 21增加一倍，需要的n 有效 减小10000倍。

增大r 21的最有效方法是选择合适的固定液。

例1、在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R =1.5 。

计算需要多少块有效塔板。

若填充柱的塔板高度为0.1 cm ，柱长是多少？ 解： r 21= 100 / 85 = 1.18
n 有效 = 16R 2 [r 21 / (r 21 —1) ]2 = 16×1.52 ×(1.18 / 0.18 )
2
= 1547（块）
L 有效 = n 有效·H 有效 = 1547×0.1 = 155 cm
即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全分离。

例2、在一定条件下，两个组分的保留时间分别为12.2s 和12.8s ，计算分离度。

要达到完全分离，即R =1.5，所需要的柱长。

§12-4. 色谱定性定量分析
一、色谱定性鉴定方法
1.利用纯物质定性的方法
利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。

不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。

利用峰高增量定性：若样品复杂，流出峰距离太近，或操作条件
不易控制，可将已知物加到样品中，混合进样，若被测组分峰高增加
72
.08133
.08533.0)
2.128.12(2=+-⨯=R m
L R R L 34.4172.05.12
12
122=⨯⎪⎭⎫ ⎝⎛=⨯⎪⎪⎭
⎫ ⎝⎛=
了，则可能含该已知物。

2．利用文献保留值定性
利用相对保留值r 21定性：相对保留值r 21仅与柱温和固定液性质有关。

在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。

3.保留指数
又称Kovats 指数(Ⅰ)，是一种重现性较好的定性参数。

测定方法： 将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷保留指数为600）
其它物质的保留指数（I X ）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z 和Z ＋1个碳原子。

被测物质X 的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：
二、 色谱定量分析方法
)
lg lg lg lg (
100')
('
)
1(')('
)
(')
('
)
('
)
1(Z t
t
t
t I t
t t Z R Z R Z R X R X Z R X R Z R +--=>>++
1. 峰面积的测量
（1）峰高（h ）乘半峰宽（Y 1/2）法：近似将色谱峰当作等腰三角形。

此法算出的面积是实际峰面积的0.94倍： A = 1.064 h ·Y 1/2
（2）峰高乘平均峰宽法：当峰形不对称时，可在峰高0.15和0.85处分别测定峰宽，由下式计算峰面积： A = h （Y 0.15 + Y 0.85 ）/ 2
（3）峰高乘保留时间法：在一定操作条件下，同系物的半峰宽与保留时间成正比，对于难于测量半峰宽的窄峰、重叠峰（未完全重叠），可用此法测定峰面积：
A = h·b·t R （4）自动积分和微机处理法 2. 定量校正因子
试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即： m i = f i ·A i
绝对校正因子：比例系数f i ，单位面积对应的物质量： f i =m i / A i
相对校正因子f i ’ ：即组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。

3.常用的几种定量方法
i
s
s i s s i i s i i A A m m A m A m f f f ⋅
===//'
（1）归一化法：
特点及要求：
归一化法简便、准确；
进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大； 仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。

（2）外标法
外标法也称为标准曲线法。

特点及要求：
外标法不使用校正因子，准确性较高， 操作条件变化对结果准确性影响较大。

对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。

（3）内标法
内标物要满足以下要求： （a ）试样中不含有该物质； （b ）与被测组分性质比较接近； （c ）不与试样发生化学反应；
（d ）出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。

试样配制：准确称取一定量的试样W ，加入一定量内标物m S 计算式：
100
)(100%1''21⨯⋅⋅=
⨯+++=∑=n
i i i i
i n
i
i A f A f m m m m c
Λ
本章总结：
作业：p240: 8、11、12、13、14、15、17。