第十二章 色谱分析法基础

第十二章色谱分析法基础教师：李国清一.教学目的：1. 熟练掌握色谱分离方法的原理；2. 掌握色谱流出曲线（色谱峰）所代表的各种技术参数的准确含义；3. 能够利用塔板理论和速率理论方程判断影响色谱分离各种实验因素；4. 学会各种定性和定量的分析方法。

二.教学重难点：1. 塔板理论，包括理论塔板数（n）、有效塔板数（n eff）和塔板高度（H）及有效塔板高度（H eff）的计算。

2. 速率理论方程3. 分离度和基本分离方程三．教具：多媒体计算机、板书。

四．教学方法：讲授、演示、提问、讨论。

五．教学过程§12-1、色谱法的特点、分类和作用一.概述色谱法是混合物最有效的分离、分析方法。

俄国植物学家茨维特在1906年使用右图的装置分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（CaCO3有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。

色素受两种作用力影响：（1）一种是CaCO3吸附，使色素在柱中停滞下来（2）一种是被石油醚溶解，使色素向下移动。

各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。

色谱法是一种分离技术：试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。

其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。

当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。

由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。

与适当的柱后检测方法结合，可实现混合物中各组分的分离与检测。

二．色谱法分类1、按两相状态分类气相色谱—气体作流动相：（1）气固色谱：气体作流动相，固体吸附剂作固定相。

（2）气液色谱：气体作流动相，固定液作固定相。

液相色谱—液体作流动相：（1）液固色谱：液体作流动相，固体吸附剂作固体相。

（2）液液色谱：液体作流动相，固定液作固定相。

超临界液体色谱——超临界流体作色谱流动相。

2、按操作形式分类（1）柱色谱：填充柱色谱—固定相填充到柱管内毛细管柱色谱—把固定相涂在毛细管内壁上，中间是空的。

（2）纸色谱：滤纸为固定相的色谱法，流动相是含一定比例水的有机溶剂，样品在滤纸上展开进行分离。

如下图。

（3）薄层色谱：把固体固定相压成或涂成薄膜的色谱法。

如下图。

3、按分离原理分类（1）吸附色谱：利用吸附剂表面对被分离的各组分吸附能力不同进行分离。

（2）分配色谱：利用不同组分在两相分配系数或溶解度不同进行分离。

（3）离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行分离。

（4）凝胶色谱：利用凝胶对分子的大小和形状不同的组分所产生的阻碍作用不同而进行分离的色谱法。

三．色谱法的特点（1）分离效率高复杂混合物，有机同系物、异构体。

手性异构体（2）灵敏度高可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。

（3）分析速度快一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。

（4）应用范围广气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。

液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。

不足之处：被分离组分的定性较为困难。

§12-２．色谱分离过程一．分离机理：色谱分离过程是在色谱柱内完成的。

填充柱色谱: 气固(液固)色谱和气液(液液)色谱，两者的分离机理不同。

①气固(液固)色谱的固定相: 多孔性的固体吸附剂颗粒。

作用原理：固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。

②气液(液液)色谱的固定相: 由担体和固定液所组成。

作用原理：固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。

因此：气固色谱的分离机理: 吸附与脱附的不断重复过程；气液色谱的分离机理：气液(液液)两相间的反复多次分配过程二、分配平衡：１. 分配系数K组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。

在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：分配系数是色谱分离的依据，它有以下特点：⑴一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；⑵试样一定时，K主要取决于固定相性质；⑶每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；⑷选择适宜的固定相可改善分离效果；⑸试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；⑹某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。

2．分配比k在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。

分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：分配比也称：容量因子、容量比。

⑴分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。

⑵分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。

⑶分配比可以由实验测得。

3. 容量因子与分配系数的关系式中β为相比（填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500）。

§12-3．色谱流出曲线与术语h1.基线无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。

2.保留值（1）时间表示的保留值保留时间（t R）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；死时间（t M）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间；调整保留时间（t R＇）：t R＇= t R－t M（2）用体积表示的保留值保留体积（V R）：V R= t R×F0F0 （m L / min）为柱出口处的载气流量。

死体积（V M）：V M = t M×F0调整保留体积(V R＇)：V R＇= V R－V M3. 相对保留值r21组分2与组分1调整保留值之比：r21 = t´R2/ t´R1= V´R2 / V´R1相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。

4. 区域宽度用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差(σ)：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。

（2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.354 σ（3）峰底宽(W b)：W b=4 σ§12-3. 色谱理论色谱理论需要解决的问题：影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。

有两种色谱理论：塔板理论和速率理论；一、塔板理论在50年代，色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论－塔板理论用于色谱分析法。

塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n个塔板，每个塔板高度称为理论塔板高度，用H表示，在每个塔板内，试样各组分在两相中分配并达到平衡，最后，挥发度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。

尽管这个理论并不完全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。

对一个色谱柱来说，若色谱柱长度固定L ，每一个塔板高度H 越小，塔板数目越多，分离的效果越好，柱效越高。

塔板数用n 表示。

n =L/H 或 H=L/nH 越小，n 越多，分离效果越好，用 H 、n 评价柱效。

由塔板理论导出n 与W b ， Y 1/2 的关系。

有时n 大，分离效果也不好，原因是保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配! 后来改用有效塔板数。

塔板理论的成功之处，提出了计算理论塔板高度、塔板数的公式及评价柱效的方法，具有开创性，但有一定局限性。

塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。

二、速率理论-影响柱效的因素1．速率理论—范第姆特方程1956年，荷兰学者范第姆特（VanDeomter）提出一个描述色谱柱分离过程中复杂因素使色谱峰变宽而致柱效降低（即：使H 增大）影响的方程。

此方程经简化后写为:H = A + B/u + C·uH：理论塔板高度，u：载气的线速度(cm/s)该式称为速率方程（范氏方程）。

下面我们将对公式中的各项进行讨论⑴A─涡流扩散项A = 2λdpdp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。

表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。

⑵B/u —分子扩散项B = 2νDgν：弯曲因子，Dg ：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm 2·s -1）a ．存在着浓度差，产生纵向扩散;b ．扩散导致色谱峰变宽，H ↑(n ↓)，分离变差;c ．分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;d ．扩散系数：Dg ∝(M 载气)-1/2 ； M 载气↑，B 值↓。

⑶ C ·u —传质阻力项传质阻力包括气相传质阻力C g 和液相传质阻力C L 即： C =（C g + C L ）其中，k 为容量因子； D g 、D L 为扩散系数。

减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。

2.载气流速与柱效——最佳流速载气流速高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速⇑，柱效⇓。

载气流速低时：分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速⇑,柱效gfg D d k k C 22)1(01.0⋅+=LfL D d k k C 22)1(32⋅+⋅=。

H - u曲线与最佳流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。

以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。

3. 速率理论的要点(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。

(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。

(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。

阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。

(4) 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。

三、色谱基本分离方程 １、分离度Ｒ可以看出，分离效果与保留时间差和峰宽有关。

分离度的表达式：R =0.8：两峰的分离程度可达89%； R =1：分离程度98%；R =1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）令W b(2)=W b(1)=W b （相邻两峰的峰底宽近似相等），引入相对保留值和塔板数，可导出下式：)(699.1)(2)(2)1(2/1)2(2/1)1()2()1()2()1()2(Y Y t t W W t t R R R b b R R +-=+-=讨论：（1）分离度与柱效分离度与柱效的平方根成正比， r 21一定时，增加柱效，可提高分离度，但组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长。