探究霉菌的筛选及其产生纤维素酶的最适Ph值

探究霉菌的筛选及其产生纤维素酶的最适Ph值

及温度条件

一．实验目的

纤维素酶(EC 3. 2. 1)是一类可广泛应用于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。探究霉菌高效生产纤维素酶的适宜条件可以为工业生产创造有利条件。有利于开发微生物产物的市场经济。

二．实验原理

能够分解纤维素的微生物很多。既有好氧性微生物，也有厌氧性微生物；既有细菌，也有放线菌和真菌。许多真菌具有很强的纤维素分解能力。其中主要有木霉、镰刀霉、青霉、曲霉、毛霉、葡萄孢霉等属的一些种。在森林的枯枝落叶中，占优势的纤维素分解菌是担子菌。在潮湿土壤中，真菌也是纤维素分解的优势菌群。

普通纤维素酶的最适作用温度多为45～65℃，Ph值为8.0。而产生纤维素酶的霉菌的生长最适温度为28~40℃，Ph值为7.0以下

三．实验用到的基本技术

微生物筛选、分离、提纯技术，无菌培养技术、摇瓶培养技术，刚果红染色法等（见参考资料）

四．1．实验仪器

250 mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1 mL和10 mL的移液管、天平、摇床、温度计、无菌培养皿、涂布器、1 mL移液管，装有9mL 无菌水的20 mL大试管，温箱等。

2．实验药品和试剂

蒸馏水，酸碱试剂，土样

五．实验步骤

1.土样采集

土样的采集要选择富含纤维素的环境（落叶堆积，阴暗潮湿的环境），这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。采集土壤下5~25cm出的土样（最好有可见菌丝）如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。

2.选择培养

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在250 mL锥形瓶中装入30 mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。

选择培养的操作：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL 培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d，至培养基变混浊。此时可以吸取0.1 mL培养液进行梯度稀释和涂布平板，也可以按课本中所述，重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。

3.刚果红染色法分离

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在500 mL三角瓶中装入200 mL培养基，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。

倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15～20 mL培养基，凝固后待用。

制备菌悬液：按照本专题课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数至106。

涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1 mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，在30 ℃倒

置培养，至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板，并注意

设置对照。

4.菌株形态学观察

取2 5℃培养4～6 d 的菌株Z 6 进行革兰氏染色、荚

膜染色，于光学显微镜下观察形态。

5. 探究真菌产生纤维素酶的最适温度

将菌株种子液分别以2 % 的接种量接入培养基中，分别在1 0 、

1 5 、

2 0 、2 5 、

3 0 和3 5、40、45、50、55、60、65 ℃下摇

床培养32h.

分别将培养后的菌株接种到等面积的棉织品布块上，每隔一小时记录布块的变化情况。

6.探究真菌产生纤维素酶的最适Ph值

将菌株种子液分别以2 % 的接种量接入培养基中，分别在Ph 值为9.0 、8. 0 、7.0 6.0、5.0、4.0、3.0时摇床培养32小时分别将培养后的菌株接种到等面积的棉织品布块上，每隔一小时记录布块的变化情况。

7.统计实验数据并绘制相应图表

六．实验结果分析和实验结论七．实验注意事项

补充：参考资料（）