免疫血清鉴定指标

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免疫血清鉴定指标

篇一：免疫血清的制备

免疫血清的制备

免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂(如用于制备

免疫标记抗体等)，也可供特异性免疫治疗用。免疫血清的

效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。…

免疫血清的制备是常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂(如用于制备免

疫标记抗体等)，也可供特异性免疫治疗用。免疫血清的效

价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加

用佐剂以增强抗原的免疫原性。免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。

一、原理

具有免疫原性的抗原可刺激机体相应b细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的b细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物(即多克隆抗体)。另外，抗体的产生具有回忆应答的规律性，牨m现为初次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。是由于记忆性b细胞参与再次应答所致。

二、免疫方法

根据抗原的性质不同而异。下面以制备家兔抗人Igg免疫血清为例作具体说明。

1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；

2.第一次免疫：用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FcA)乳化的抗原(人Igg)下称FcA-Igg)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。

3.第二次免疫：间隔10-14天后，于两侧窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FcA-Igg，每淋巴结注0.1ml，其余注入

淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，

直接注入两侧窝及鼠蹊部皮下。

4.间隔7-10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。

5.若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人Igg)

耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人Igg)(简称FIA-Igg)再免疫1-2次。注射部位、剂

量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。

三、放血

(一)心脏采用血法

1.家兔仰面，四肢缚于动物固定架上(或由助手抓住四

肢固定)；

2.剪去左胸部兔毛，消毒皮肤；

3.用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位；

4.用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死；

5.将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。

(二)颈动脉放血法

1.家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤；

2.沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至

暴露出气管两侧的胸锁乳突肌；

3.分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离；

4.于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住；

5.用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱；

6.松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。

四、分离血清

1、将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时

2、再置4℃冰箱内3～4小时。

3、待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。

4、于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)

5、分装后置4℃冰箱中保存备用。

五、结果鉴定

以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价，并用琼指免疫电泳鉴定免疫血清中抗体的质量，应产生单一的沉淀弧线。鉴定方法的具体步骤参见有关部分。

六、材料

(一)动物：健康成年家兔，雄性，体重2～3公斤。

(二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。

(三)试剂

1.灭菌生理盐水；

2.纯化人Igg(10mg／ml)；

3.消毒酒精及碘酒；

4.羊毛脂；

5.石蜡油；

6.活卡价苗(bcg)(75mg／ml)；

7.弗氏不完全佐剂(FIA)制备：称羊毛脂10克，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中(每瓶

10ml)，高压灭菌(8磅20分钟)后保存备用。

8.弗氏完全佐剂乳化抗原(FcA-Igg)的制备：将FIA予温(60℃30分钟)，吸取3ml于研钵中，逐滴加入活bcg(75mg ／ml)0.5ml及纯化人Igg2.5ml(2.4mg／ml)牨_滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。

七、注意事项

1.免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因

篇二：临床免疫和免疫检验实验指导

临床免疫和免疫检验实验指导

（一）免疫血清的制备与鉴定

实验一、免疫血清的制备

机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产

生体液免疫（抗体）和细胞免疫（致敏的T淋巴细胞及其产物多种淋巴因子）的过程。一种抗原能否引起免疫反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的抗原决定簇。另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。上述条件具备时，抗原经合适途径，选择合适剂量及次数，进入机体内，经过一段潜伏期，抗体水平就逐渐升高，维持高峰，既高效价抗体。利用此原理可制备血清学试验所需的抗血清、各种免疫球蛋白及溶血素等。