双水相萃取实验

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生化物质分离纯化基础实验
标准曲线图： 标准曲线图： OD = K · μg ＋ b 求斜率K和截距b 求斜率K和截距b
µg OD
上相
OD − b C上 = × 100 K
OD − b 1 C下 = × K 0 .1
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µg / ml
µg / ml
下相
生化物质分离纯化基础实验 ● 思考和讨论: 思考和讨论:
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生化物质分离纯化基础实验
（二）比色测定上、下相蛋白质浓度： 比色测定上、下相蛋白质浓度：
◆ 1. 试剂配制 考马斯亮兰G 250溶液配制： 考马斯亮兰G-250溶液配制： 溶液配制
精确称取50mg考马斯亮兰，溶于10ml 95%乙醇中，并 乙醇中， 精确称取50mg考马斯亮兰，溶于10ml 95%乙醇中 50mg考马斯亮兰 加入50ml 浓磷酸，然后， 稀释定容至500ml 500ml。 加入50ml 85% 浓磷酸，然后，用H2O稀释定容至500ml。 2. 牛血清蛋白溶液配制： 牛血清蛋白溶液配制： 精确称取0.012g左右的牛血清蛋白，加入0.105gNaCl, 精确称取0.012g左右的牛血清蛋白，加入0.105gNaCl, 0.012g左右的牛血清蛋白 溶于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至100ml 100ml， 溶于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至100ml，配成 120µg/ml的牛血清蛋白原液 的牛血清蛋白原液。 120µg/ml的牛血清蛋白原液。
澄清 混均 浑浊 记录(NH4)2SO4 记录 ml数 数
PEG400%
按表格重复操作… 按表格重复操作
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(NH4)2SO4%
生化物质分离纯化基础实验
表1.
PEG400 = ______ g
次 数 H2O g (NH4)2SO4溶液加量 ml g
相图制作表
温度 = ______℃ ℃
纯(NH4)2SO4 溶液累 累计量 g 计总量 g PEG
牛血清蛋白ml 牛血清蛋白ml H2O ml 0.2 0.8 0.8 0.2 0.4 1.0来自百度文库0.6 / 0.6 0.4
上相液1.0ml 上相液1.0ml 下相液0.1ml 下相液0.1ml 0.9ml
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加考马斯亮兰5.00ml，混匀，25℃±1℃保温10分钟， 加考马斯亮兰5.00ml，混匀，25℃±1℃保温10分钟，冷却 5.00ml 保温10分钟 蛋白质总重µ 蛋白质总重µg OD（595nm） OD（595nm）
加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇， 一. 加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇，直至固体全 部溶解，原因是什么？ 部溶解，原因是什么？ 选择正确的离心操作顺序: 二. 选择正确的离心操作顺序: 将装有相等体积的两只离心试管(水和样品液) 1. 将装有相等体积的两只离心试管(水和样品液)对称放 在离心机中。 在离心机中。 2. 将两只装有液体的离心试管放入套管中一起称重平衡 对称放在离心机中。 对称放在离心机中。 选择正确的吸出上、下相操作方法： 三. 选择正确的吸出上、下相操作方法： 1. 吸管小心插入下相，吸出下相 吸管小心插入下相， 换吸管，吸出 换吸管， 上相。 上相。 插入下相，吸出下相。 2. 吸管小心吸出上相 插入下相，吸出下相。 3. 吸管小心吸出上相 将多余上相和少量下相弃 换吸管，吸出下相。 去 换吸管，吸出下相。 11
P 两相区 互溶区 Q
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生化物质分离纯化基础实验 二. 相图的制作方法
(一) 溶液配制 一 配制43.00%（g/ml）的（NH4)2SO4溶液： （ 溶液： 配制 ） 溶液 称硫酸胺 215.0g 稀释至 500ml 少量水 溶解 密度计测 密度
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生化物质分离纯化基础实验 （二）相图的制作
PEG400 0.700g H2 O 0.5ml (NH4)2SO4 混和 H2 O 0.3ml
2. 考马斯亮兰（Coomassie Brilliant Blue G-250） 比色 考马斯亮兰（ ） 法测定两相中蛋白质浓度：考马斯亮兰 － 法测定两相中蛋白质浓度：考马斯亮兰G－250是一种 是一种 染料，酸性溶液中呈棕红色。 染料，酸性溶液中呈棕红色。与蛋白质通过范德华键 结合成兰色复合物， 波长有最大吸收值。 结合成兰色复合物，595nm波长有最大吸收值。 波长有最大吸收值 低浓度时，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。 低浓度时，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。
生化物质分离纯化基础实验
可调式移液器（ 正确的操作方法（是非题）： 四. 可调式移液器（枪）正确的操作方法（是非题）： 1. 要吸取 要吸取0.4ml液体，可用1000 ~ 5000 µl 规格的枪。 液体，可用 规格的枪。 液体 2. 向顺时针方向旋，数值减小；逆时针方向旋，数值增 向顺时针方向旋，数值减小；逆时针方向旋， 大。 3. 下列操作哪一个正确： 下列操作哪一个正确： (a) 吸液时向下按到第一停点；放液时向下按到第二停 吸液时向下按到第一停点； 点。 (b) 吸液时向下按到第二停点；放液时也向下按到第二 吸液时向下按到第二停点； 停点。 停点。
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生化物质分离纯化基础实验
二. 操作方法 （一）蛋白质在两相中的分配： 蛋白质在两相中的分配：
10ml刻度 10ml刻度 离心试管 加入糖化酶 2.00ml 振摇混和 (固体溶解) 固体溶解) 求蛋白质分配系数 K = C上/ C下 加(NH4)2SO4 固体1.30 1.30克 固体1.30克 加水 离心 3000转 3000转/分 5min 加PEG400 2.00克 2.00克 总重8.00g 总重8.00g 求相比 R =V上/V下
%(g/g)
(NH4)2SO4溶液浓度 43.00 % (g/ml) 密度 1.20 g 溶液 /ml溶液 溶液
(NH4)2SO4
%(g/g)
1 2 3 4 5 6 7
0.5 0.3 0.3 0.3 0.5 0.5 0.5
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生化物质分离纯化基础实验 两水相系统中蛋白质分配系数的测定
一. 实验原理
1. 糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同程度 糖化酶为生物大分子蛋白， 地分配，分配系数 K = C上/ C下。 地分配， 相比R = V上/ V下 相比
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生化物质分离纯化基础实验
标准曲线制作方法： ◆ 标准曲线制作方法：见下表 上相液：吸取0.5ml 蒸馏水定容至50ml ◆ 上相液：吸取0.5ml 蒸馏水定容至50ml 按 下表操作。 下表操作。 下相液：直接按下表操作。 下相液：直接按下表操作。 空白液：吸取1.0ml 考马斯亮兰液。 空白液：吸取1.0ml 蒸馏水 ＋ 5ml 考马斯亮兰液。 表1. 标准曲线和样品的测定 牛血清蛋白浓度 120 µg /ml
生化物质分离纯化基础实验
两水相萃取蛋白质的相图 及分配系数
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生化物质分离纯化基础实验
PEG/(NH4)2SO4两水相系统的相图 两水相系统的相图
一. 实验原理 高聚物与无机盐成相的原因： 高聚物与无机盐成相的原因： 无机盐盐析作用。 无机盐盐析作用。 用相图表示两水相形成的条件和定量关系， 用相图表示两水相形成的条件和定量关系， 它是一根双节线（binodal）。 它是一根双节线（binodal）。