WB实验组织总蛋白提取方法

WB组织总蛋白提取步骤
第一步提取组织蛋白上清液
1，准备裂解液
（1）溶PMSF（将PMSF晶体溶到PMSF溶剂中，即配成10ml100mM的PMSF液体）（2）裂解液的制备
组成：PIRA裂解液+PMSF溶剂+蛋白酶抑制剂
10mlPIRA=100ulPMSF=1片蛋白酶抑制剂
（3）将配好的裂解液放在4℃备用。

2，研磨组织（心尖）
（1）准备研钵，药勺（2把），长镊子，保温箱（里面放入冰块），汤勺，离心管，天平，手套（2幅），液氮，冰盘，振荡器。

（2）将所有接触到组织的工具用液氮预冷。

（3）1人负责将组织组织给研磨者并随时加液氮（此人必须记住每次研磨者所研磨的组织的编号）2人研磨组织（多次快速），同时一人将1.5ml离心管编号预冷去皮。

（4）将研磨好的组织放在去皮处理的对应的离心管中称重。

（用大白纸记录好每个样的重量，便于离心时配平用）。

（5）加裂解液（1mg组织加6ul裂解液）。

（6）震荡混匀后放入冰盘上，等所有的样加完后一齐在摇床上摇1h。

3，离心提取蛋白上清液
（1）提前30min预冷离心机（4℃）。

（2）配平。

（3）离心，按照配平时的组放样（13000r，5min）。

（4）取上清液，储存在-20℃备用。

（提前将1.5ml的离心管编号）。

第二步BCA法测蛋白浓度
1，37℃预热水浴箱
2，配蛋白标准液
（1）准备9个1.5ml离心管并编号A,B,C,D,E,F,G,H,I
（2）按照说明书配制标准样。

3，将蛋白上清液稀释十倍
（1）准备0.5ml的离心管并编号。

（2）取上清液6ul，然后加入54ul蒸馏水，震荡混匀。

2，配BCA工作液
Ragent A：B=50:1
工作液所需用量计算：
总体积=（n待测样+9标准样）×2×200ul
其中A液xx，B液xx。

3，向酶标板（96孔板）中加入蛋白和工作液
先加25ul蛋白，再加200ul工作液，每个样加两个孔。

96孔板视图
123456789101112
4，加完工作液后摇床摇30min，放入37℃水浴30min。

（最好盖上盖）
5，预热酶标仪37℃
6，酶标仪使用方法
（1）打开MPM6软件
（2）File-New
（3）文件-Intrument-Setup-Single-波长562nm-OK
（4）File-Read new plate
（5）Expert Date：Max
7，根据OD值的平均数用EXCEL计算浓度（记得x10）。

第三步制备上样蛋白
1，计算500ul上样蛋白组成
蛋白上清液+1x样缓（固定5x样缓100ul）+超纯水（可用蒸馏水代替）
（1）计算500ul上样量所需的蛋白体积
V
蛋白
=2ug/ul×500ul/实际蛋白浓度（ug/ul）（注意：2ug/ul可以根据实际情况调整的）（2）计算所需超纯水体积
V
水=500-100-V
蛋白
（3）数据用excel计算并提前打印。

2，准备1.5ml的离心管编号。

3，将提前将5x样缓取出解冻。

4，按照excel表中数据在离心管中加入蛋白上清液，样缓以及超纯水。

5，震荡混匀。

6,100℃水浴15min。

7，分装备用。

作者：尹懿
北京体育大学运动人体科学学院2012级本科。